西普库鲁斯核素体液的原位杂交
Summary
该协议描述了一种有效的原位杂交方法，用于检测西普库鲁斯核糖体流体中目标基因的mRNA表达水平和空间模式。
Abstract
原位杂交 （ISH） 是一种非常翔实的技术，用于在组织中呈现特定基因（例如 mRNA 和 ncRNA）的细胞分布模式。虹吸虫西潘库鲁斯核苷，是一种重要的渔业资源，因为它具有较高的营养和药用价值。目前，西潘库鲁斯核子分子生物学的研究还处于起步阶段。本文的目的是开发一种敏感的方法，用于在虹吸虫核糖体流体中局部特定的mRNA。该协议包括ISH的详细步骤，包括二戈西根宁标记的抗感觉和感觉核探针制备、共母液收集和截面制备、特定的核试探杂交、抗体孵育、着色和着色后处理。演示了使用该方法的成功实验取得的代表性结果。该协议也应适用于其他西潘库拉物种。
Introduction
ISH，使用标记的核酸探针来检测特定的DNA或RNA感兴趣的序列，是描述形态保存组织11、2、32,3中目标基因的空间表达模式的有用方法。通常，目标序列由聚合酶链反应（PCR）生成，然后用作模板，合成标有二戈西根尿碱-5′-三磷酸的抗感觉/感觉RNA探针。样品在用核试探孵育前固定并渗透。洗掉多余的探针后，利用抗地氧辛抗体，即碱性磷酸酶33、4、5、6，4,5,6通过免疫组织化学进行可视化。
西潘库鲁斯努杜斯（菲勒姆·西潘库拉;命令西潘库利达：西潘库利达）是一种未分割、共和和双边对称的海虫77、8。8虹食核生物是一种国际性物种，广泛分布于热带和温带沿海水域。也是中国南方重要的海洋渔业资源，因其高营养和药用价值9,9，10。然而，分子生物学中的西普库鲁斯核苷也还处于起步阶段。为了充分理解基因的生物作用，对细胞分辨率下的基因表达模式进行调查是十分感兴趣的。在非模型生物Sipunculusnudus中，ISH方法是检测基因表达模式的理想方法，但至今尚未建立。其共母体流体包含多种细胞类型，包括粒细胞、urn细胞、细胞、生殖细胞、红细胞等11种。双性/mab-3相关转录因子1（dmrt1），作为这种方法的代表性基因，是一种高度保守的转录调节器，在大多数物种，从无脊椎动物到哺乳动物12，13。,13在一系列物种中（如黑色毛孔等）14 14，dmrt1表示在Sertoli细胞，围绕生殖细胞，其功能类似于西潘库鲁斯核细胞的营养细胞。因此，我们假设，虹膜核糖的dmrt1表示在精子的营养细胞中，ISH方法的结果明确证实了这一假设。
该协议首次描述ISH，用二戈西根宁标记的抗感觉/感觉mRNA探针，以确定mRNA表达模式在其共发流体涂片。提供最佳反应条件，允许在高分辨率下对mRNA表达进行非常敏感的可视化。开发的ISH方法可能应用于西潘库利达物种以外的西普库利达物种。
Protocol
动物程序经华桥大学动物福利委员会批准。 1. 核试探准备 底漆设计 打开程序引页 3 （http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）。将dmrt1序列（GenBank： MK182259）复制到序列窗口中。 设置底漆长度（23-25 bp）、熔融温度（55-60°C）和G/C含量（40-60%）。单击”选取底漆”。注：RNA探针所需的最小尺寸约为500bp。较长的探针通常具有较高的特异性。…
Representative Results
图 1中说明了 ISH 中涉及的步骤的摘要。从从共性流体cDNA放大的PCR产物中合成了dmrt1的抗感觉和相应的感觉核探针。通过直接测序验证了PCR产品的真实性。根据制造商的协议和以前的报告4，使用T7RNA聚合器合成了Riboprobes，并进行了一些小的修改。ISH 的代表性信号如图2所示。以dmrt1为目标的西潘库鲁斯核糖体流体的I…
Discussion
先前的研究表明，ISH适用于探测多个目标RNA16、17、18。,17,18在此协议中，我们描述了一种高分辨率ISH方法，用于检测共分液中的mRNA，并强调西潘库鲁斯核糖的优化杂交条件。我们观察到的dmrt1的明显信号证明了该协议在基因表达检测中的成功应用（图2）。
在实验中，需…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金（第31801034号）、中国福建省自然科学基金（2016J01161）、华桥大学科研基金（15BS306）和华桥大学科研研究生创新基金的支持。
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Referências
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Citar este artigo
Li, W., Yuan, M., Wu, Y. In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid. J. Vis. Exp. (159), e61022, doi:10.3791/61022 (2020).