Flowcytometrie gebruiken om veranderde bloedvorming in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren en te kwantificeren
Summary
Deze test is een eenvoudige methode om hematopoëtische cellen te kwantificeren bij de ontwikkeling van embryonale zebravissen. Bloedcellen van gedissocieerde zebravissen worden onderworpen aan flow cytometrie analyse. Dit maakt het mogelijk om bloeddefecten bij gemuteerde dieren en na genetische modificatie te detecteren.
Abstract
De diversiteit van cellijnen die volwassen bloed in gewervelde dieren omvatten, komt voort uit de differentiatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Dit is een kritisch proces dat optreedt gedurende de hele levensduur van organismen, en verstoring van de moleculaire paden die betrokken zijn bij embryogenese kan catastrofale gevolgen op lange termijn hebben. Om een veelheid van redenen is zebravis (Danio rerio) een modelorganisme geworden om hematopoiese te bestuderen. Zebravisembryo’s ontwikkelen zich extern en hebben na 7 dagen postfertilisatie (dpf) de meeste subtypes van definitieve bloedcellen geproduceerd die hun leven lang zullen aanhouden. Er zijn testen ontwikkeld om het aantal hematopoëtische cellen te beoordelen, voornamelijk met behulp van specifieke histologische vlekken, in situ hybridisatietechnieken en microscopie van transgene dieren die bloedcelspecifieke promotors gebruiken die de expressie van fluorescerende eiwitten stimuleren. De meeste kleuringstesten en in situ hybridisatietechnieken kwantificeren echter niet nauwkeurig het aantal aanwezige bloedcellen; alleen grote verschillen in celnummers zijn gemakkelijk te visualiseren. Het gebruik van transgene dieren en het analyseren van individuen met fluorescerende of confocale microscopie kan worden uitgevoerd, maar de kwantificering van deze testen is afhankelijk van handmatig tellen of het gebruik van dure beeldvormingssoftware, die beide fouten kunnen maken. De ontwikkeling van aanvullende methoden om het aantal bloedcellen te beoordelen zou economisch, sneller en zelfs geautomatiseerd zijn om snel het effect van CRISPR-gemedieerde genetische modificatie, morfolino-gemedieerde transcriptiereductie en het effect van medicijnverbindingen die hematopoiese op grote schaal beïnvloeden, snel te beoordelen. Deze nieuwe test om bloedcellen te kwantificeren wordt uitgevoerd door hele zebravisembryo’s te dissocieren en de hoeveelheid fluorescerend gelabelde bloedcellen te analyseren. Deze assays moeten het mogelijk maken om moleculaire routes op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de vorming, uitbreiding en regulatie van bloedcellen tijdens embryogenese, waardoor onderzoekers nieuwe factoren kunnen ontdekken die zijn veranderd tijdens bloedziekten, evenals paden die essentieel zijn tijdens de evolutie van gewervelde hematopoiese.
Introduction
Bloedproductie (hematopoiese) is een essentieel ontwikkelingsproces dat voor het eerst begint in het vroege embryo. Dit proces begint met het genereren van primitieve rode bloedcellen en macrofagen rechtstreeks van mesoderm, en verschuift later naar de productie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Deze stamcellen, die multipotent zijn, genereren alle variëteiten van volwassen bloedcellen in het organisme. In staat tot zelfvernieuwing wordt het systeem voortdurend aangevuld via deze HSPCs. Hoewel dit proces vroeg in de ontwikkeling begint, gaat hematopoiese door voor het leven van het dier, waardoor zuurstof naar verre plaatsen van het lichaam kan worden getransporteerd, bloedingen na letsel kunnen worden gestopt en het lichaam tegen infectie kan worden beschermd. De ontwikkeling van dit complexe systeem wordt tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd tijdens de ontwikkeling en eventuele verstoringen in de bloedcelproductie kunnen catastrofaal zijn voor het organisme, wat resulteert in bloedarmoede, trombocytopenie, leukopenie en leukemie.
Een populair diermodel dat wordt gebruikt voor hematopoëtisch onderzoek is de zebravis (Danio rerio) omdat ze een vergelijkbare bloedontwikkeling hebben in vergelijking met mensen. In feite worden veel van de genen en moleculaire paden die tijdens hematopoiese worden gebruikt, bewaard tijdens de evolutie van gewervelde dieren, waardoor we meer te weten kunnen komen over menselijke genen door zebravissen te bestuderen. Belangrijk is dat zebravisembryo’s zich buiten het lichaam ontwikkelen en binnen 7 dagen de meeste volwassen bloedceltypen hebben gegenereerd, waardoor het hematopoëtische systeem in korte tijd direct kan worden gevist. Zebravissen zijn ook extreem vruchtbaar, waardoor onderzoekers in korte tijd een groter aantal monsters kunnen observeren, wat ook belangrijk is voor het genereren van reproduceerbare gegevens. De korte generatietijd en externe ontwikkeling van de zebravis zorgt voor eenvoudigere manipulatie en observatie tijdens mutagenesestudies1,2,3,4,5 en drugsscreening6,7,8,9,10. Hierdoor kan een panel van veelbelovende therapeutische verbindingen voor menselijke bloedaandoeningen snel en efficiënt worden getest.
Belangrijk is dat zebravissen ook genetisch vatbaar zijn en dat het genoom wordt gesequenced en geannoteerd. Deze tractabiliteit maakt het mogelijk om omgekeerde genetische technieken zoals morfolino- (MO-) gemedieerde knockdown en CRISPR-gemedieerde genetische ablatie uit te voeren. Zebravissen hebben ook hun nut bewezen als model om voorwaartse genetische schermen uit te voeren; veel essentiële genen en paden die betrokken zijn bij gewervelde bloedvorming zijn op deze manier ontdekt. Talrijke methoden voor het observeren van bloedcellen zijn ook ontwikkeld bij zebravissen. Hoewel er traditionele histologische kleuringstechnieken bestaan, is het ook mogelijk om in situ hybridisatie uit te voeren voor bloedspecifieke transcripties. Belangrijk is dat er ook tal van transgene vislijnen bestaan waarbij fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt door afstammingsspecifieke promotors, waardoor de etikettering van specifieke bloedcellen met fluorescerende eiwitten11mogelijk is. Dit stelt onderzoekers in staat om up-to-the-minute observatie van het ontstaan, de expansie en de regulatie van bloedcellen in een levend organisme in de loop van de tijd uit te voeren.
Over het algemeen heeft het behoud van het hematopoëtische systeem, de aanwezigheid en gemakkelijke ontwikkeling van transgene lijnen, eenvoudige visualisatie en korte generatietijd de zebravis een economisch, snel en aanpasbaar model van hematopoiese gemaakt. Om de toolbox met technieken voor zebravisonderzoekers te verbeteren, ontwikkelden we deze test om het aantal bloedcellen in embryo’s robuust te kwantificeren. De methode omvat het verteren van transgene dieren en het uitvoeren van flowcytometrie voor fluorescerende bloedcellen. Op deze manier kunnen bloedcellen van gemuteerde dieren, het effect van MO- en CRISPR-modificatie en het effect van kleine moleculen op een snelle en reproduceerbare manier kwantitatief worden geanalyseerd. Deze onderzoeken zijn gebruiksvriendelijke en economische manieren om bloedcellen op te sommen, waardoor onderzoek van hun generatie, proliferatie en onderhoud in de loop van de tijd mogelijk is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravissen zijn een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde hematopoiese. In de afgelopen decennia zijn meerdere tests ontwikkeld en verfijnd, waardoor zebravissen een snel en economisch model kunnen worden voor het testen van medicijnen, het genereren en testen van genetische mutanten, en over het algemeen kunnen onderzoekers moleculaire paden analyseren die essentieel zijn voor hematopoiese. Dit protocol maakt gebruik van embryonale zebravissen die snelle gegevensverzamelin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 aan D.L.S.), de National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 tot D.L.S.), en van het Honor’s Program aan california state university Chico (naar K.F.R.). De auteurs bedanken Betsey Tamietti voor laboratoriumbeheer en Kathy Johns voor administratieve hulp.
Materials
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
Referências
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. , 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. . Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Biologia do Desenvolvimento. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
