测量组织肿瘤组织切片的实时药物反应
Summary
我们介绍了一种用于测量有机肿瘤组织切片中实时药物反应的协议。此处概述的实验策略为在临床或小鼠肿瘤的临床或小鼠肿瘤衍生的组织切片上进行中高通量药物屏幕的平台。
Abstract
肿瘤组织由癌细胞、渗透免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞和细胞外基质组成。这种复杂的环境构成肿瘤微环境（TME），可以调节对体内治疗或药物反应的反应。传统的癌症药物发现屏幕是在单层培养的细胞上进行的，这个系统严重缺乏TME的影响。因此，将敏感和高通量测定与生理TME相结合的实验系统将加强临床前药物发现过程。在这里，我们介绍活体肿瘤组织切片培养作为中高通量药物筛选的平台。组织组织切片培养构成精确切割的薄肿瘤部分，在液-空气界面中多孔膜的支持下进行维护。在此协议中，我们描述了从小鼠肿瘤和患者衍生异种移植 （PDX） 模型中制备的组织切片的制备和维护。为了评估组织活力的变化，以回应药物治疗，我们利用了基于生物相容性发光的生存能力测定，能够实时、快速和灵敏地测量组织中的活细胞。利用这个平台，我们评估了组织切片对多激酶抑制剂、松孢菌素和细胞毒性剂多索鲁比辛的剂量依赖反应。此外，我们通过将17种临床和临床前药物筛选出从单个PDX肿瘤制备的组织切片上，证明了组织切片在体内药理学中的应用。我们的生理相关、高度敏感、健壮的外体筛查平台将大大加强临床前肿瘤药物的发现和治疗决策。
Introduction
癌细胞与周围基质组织的物理和生化特性相互作用形成TME。TME可以刺激肿瘤生长，转移，并调节肿瘤反应的治疗1。在传统的临床前药物开发中，药物候选药物通常首先使用培养的癌细胞系进行筛选，这是一个严重缺乏TME2的测定平台。这种在细胞预筛选阶段缺乏生理TME可能限制在含肿瘤动物模型中发现有效制剂，并可能导致许多有前途的肿瘤药物在发育后期阶段出现高流失率。
尽管TME在调节肿瘤药物反应方面的重要性，但实验约束限制了在药物发现和开发的早期阶段应用更具有生理相关性的系统。从动物模型或患者肿瘤标本中筛选数百种肿瘤治疗剂是不切实际的。事实上，手术标本是具有不同遗传背景的稀缺资源，由于实验规模、成本和动物福利，在动物模型中筛选数千种候选分子是不可行的。
肿瘤组织切片培养，其中精确切割，薄肿瘤部分培养外活体，可以解决生理TME在药物筛选检测中的局限性。从历史上看，神经科学领域开创了脑组织切片培养的先河，并进行了广泛的优化。最近，许多研究已经证明了从所有类型的肿瘤组织切片的准备，包括细胞系衍生肿瘤，自发肿瘤模型，患者衍生异种移植（PDX）和原发性患者肿瘤。外活体组织切片培养整合了体内和体外培养5的益处。肿瘤组织切片保留完整的组织结构及变状细胞组成，从而在TME语境内研究癌细胞。
该协议引入了一种组织性肿瘤组织切片培养系统，结合实时、高灵敏度的生存能力测定来评估药物反应。在以前引入的协议中，对有机肿瘤组织切片的药物疗效测试依赖于通过荧光染料合并、免疫组织化学（IHC）或MTT（（3-4、5-二甲基苯甲酸酯-2-yl_-2、5二苯基四苯基溴化）测定66、7、8、97,8,9来测量细胞生存能力的变化。然而，这些方法都是端点测定，灵敏度低，处理时间长，数据分析复杂，信号范围窄，实验误差高。我们的基于发光的活细胞兼容试剂通过提供广泛的信号范围和即时（±5 分钟）测量，无需事先处理和最少的后处理，从而改进了这些检测。这种试剂高度敏感，可以在细胞培养培养培养培养培养基中共存，从而能够连续和时间程测量细胞的可行性。该检测系统适用于临床前药物开发中组织切片药物候选药物的高通量筛选。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该协议中，我们演示了一个对有机肿瘤组织切片进行定量和实时药物疗效研究的平台。组织切片培养系统通过捕捉原生肿瘤微环境的细胞异质性和生理特征，比传统的细胞体外方法具有明显的优势。该平台还提高了药物疗效测试的吞吐量，有助于弥合细胞培养研究与体内实验之间的差距。
为了获得准确和一致的结果，在制备过程中必须尽量减少组织损伤。组织切片应用宽?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH/NCI[K22CA201229，P30CA015704]和西德尼·金梅尔基金会[金梅尔学者奖]、肺癌发现奖（LCD-505536）的支持。我们要感谢阿拉娜·韦姆博士（犹他大学）提供乳腺癌PDX肿瘤。我们还要感谢比较医学、弗雷德·哈钦森癌症研究中心（FHCRC）的工作人员对PDX模型的维护以及Gujral实验室的成员进行了有益的讨论。N.N.A得到JSPS海外研究奖学金和FHCRC跨学科培训赠款的支持。A.J.B.由FHCRC的染色体代谢和癌症培训补助金提供支持。
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
Referências
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
