Kvantificering human norovirus virus-lignende partikler bindende for commensal bakterier ved hjælp af Flow cytometri

Summary

Målet med denne protokol er at kvantificere bindingen af det eukaryote patogenhumane norovirus til bakterier. Efter at have udført en indledende virus-bakterie vedhæftet fil assay, flow cytometri bruges til at opdage viralt-bundet bakterier i befolkningen.

Abstract

Commensal bakterier er veletableret til at påvirke infektion af eukaryote vira. Direkte binding mellem patogenet og værtsmikrobiomet er ansvarlig for at ændre infektion for mange af disse vira. Således, karakterisere karakteren af virus-bakterier bindende er et grundlæggende skridt er nødvendig for at belyse den mekanisme (r), som bakterier ændrer virusinfektion. For humannorovirus, tilsvarende bakterier øge B celle infektion. Virussen direkte binder sig til disse bakterier, hvilket indikerer, at denne direkte interaktion er involveret i mekanismen for infektion ekstraudstyr. En række teknikker kan anvendes til at kvantificere interaktioner mellem bakterier og vira, herunder scintillation stælling af radioaktivt mærkede vira og polymerase kædereaktion (PCR). Begge metoder kræver brug af levende virus, som kan være nødvendigt at generere i laboratoriet. I øjeblikket er ingen af de etablerede in vitro-kultursystemer til rådighed for humant norovirus robuste nok til at give mulighed for generering af stærkt koncentrerede viruslagre. I stedet for levende virus, virus-lignende partikler (VLPs) er blevet brugt til at karakterisere samspillet mellem norovirus og bakterier. Heri en flow cytometri metode er beskrevet med anvendelser virus specifikke antistoffer til at kvantificere VLP binding til gram-negative og gram-positive bakterier. Inddragelse af både bakterier kun og isotype kontrol tilladt for optimering af analysen for at reducere baggrunden antistof bindende og nøjagtig kvantificering af VLP vedhæftet fil til de testede bakterier. Høje VLP:bakterieforhold resulterer i, at VLPs binder sig til store procentdele af bakteriepopulationen. Men når VLP mængder er faldet, procent af bakterier bundet også falder. I sidste ende, denne metode kan anvendes i fremtidige eksperimenter belyse de specifikke betingelser og strukturelle komponenter, der regulerer norovirus: bakterielle interaktioner.

Introduction

Human noroviruses (HuNoVs) er den hyppigste årsag til gastrointestinal sygdom på verdensplan, ansvarlig for 685 millioner infektioner og over 200.000 dødsfald hvert år¹. Som med andre enteriske vira, tilstedeværelsen af kommensal bakterier har vist sig at øge infektion af dette patogen samt dens surrogat virus, murine norovirus^2,3. Der er også modstridende rapporter om, at bakterier kan hæmme infektion med humannorovirus^4,5,6. For flere vira synes den direkte interaktion mellem virus og bakterier at ligge til grund for de mekanismer, der påvirker virusinfektion^2,7,8,9,10, og det er blevet vist gennem elektronmikroskopi, at humane norovira binder sig direkte til overfladen af bakterier ne^11,12. Derfor, karakterisere disse interaktioner er blevet afgørende for at bestemme de mekanismer, som bakterier indvirkning virusinfektion. Denne karakteristik er klassisk begyndt med kvantificering af viral binding til en række bakteriearter , der er komponenter i værtsmikrobiomet^7,12,13. Disse vedhæftede analyser ikke kun afsløre mængden af virus bundet til bakterier, men også støtte til bestemmelse af virkningen af denne interaktion på viral fitness og overlevelse.

For at kvantificere viral fastgørelse omfatter traditionelt anvendte metoder PCR-baserede analyser , som kvantificerer virale genomer¹² eller genereringen af radioaktivt mærket virus og brugen af scintillationstælling til kvantificering af viruspartikler^7,8,9,13. Anvendelsen af disse metoder kræver generelt adgang til lagre af virus med høj titer og in vitro-dyrkningsmetoder, som de kan anvendes til. Mens flere kultursystemer for humant norovirus nu findes^2,14,15, ingen understøtter den robuste replikation kræves for at generere disse stærkt koncentrerede bestande, som begrænser eller eliminerer brugen af PCR og scintillation tælle at kvantificere menneskelige norovirus / bakterielle interaktioner.

For at omgå dette problem, virus-lignende partikler (VLPs) kan bruges som et surrogat til levende virus til at undersøge interaktioner mellem humannorovirus og bakterier^16,17. VlPs er ikke-infektiøse partikler, der ligner den virus, som de er afledt af. I tilfælde af humannorovirus dannes disse partikler fra ekspressionen af VP1-proteinet (og engang VP2-proteinet), som selv samler for at skabe intakte virale kapeller, der mangler genetisk materiale (dvs. RNA for norovira). Disse VLP’er har været velkarakteriserede, er strukturelt og antigent magen til de vira af vildtypen , som de stammer fra^{18,19,20,21,22,23}. Derfor, VLPs tjene som en ideel surrogat for at undersøge overfladen interaktioner mellem human norovirus og commensal bakterier. Da VLPs mangler genetisk materiale, kan PCR-baserede analyser ikke anvendes til kvantificering af viral binding. En antistofbaseret cytometrimetode blev tidligere beskrevet og i stand til at påvise lave niveauer af VLP-binding til bakterier på en semikvantitativ måde¹⁶. Denne metode blev optimeret til at muliggøre nøjagtig kvantificering af humant norovirus VLP binding til både gram-negative og gram-positive kommensal bakterier¹⁶.

Protocol

BEMÆRK: De bakterievækstbetingelser, der er skitseret i protokollen, er standarddyrkningsbetingelser for Enterobacter cloacae og Lactobacillus gasseri. For at udføre virus:bakterier vedhæftet fil assay med andre bakteriearter, bør de valgte bakterier dyrkes under standard betingelser, der passer til bakterien. 1. Forberedelse bakterievækst Medium Enterobacter cloacae vækst medier Der fremstilles flydende medium ved at opløse 10 g tryptone, …

Representative Results

De gatingstrategier , der anvendes til at kvantificere humant norovirus VLP-binding til kommensalbakterier, er vist i figur 1. Repræsentativ densitetprik giver et overblik over, hvordan prøverne blev gated for at eliminere cellulære rester og celleklumper, så VLP-fastgørelseblev bestemt på enkelttpopulationer (figur 1A). Repræsentative histogrammer demonstrerer lave niveauer af anti-norovirus antistofsigna…

Discussion

Evnen til at kvantificere binding af enteriske vira til bakterier er et kritisk første skridt for at belyse de mekanismer, som disse bakterier ændrer virusinfektion. De metoder, der er beskrevet heri, er blevet optimeret til at måle humane norovirus VLP interaktioner med både E. cloacae (gram-negative bakterie) og L. gasseri (et gram-positiv bakterie), men kan tilpasses til brug med pattedyr virus og bakterie af interesse. Mens VLPs er et ideelt alternativ til levend…

Materials

5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap	Corning	352235	After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar	Sigma	A7002	Used for media preparation
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605	Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)	BD Biosciences	554657	Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder	BD Biosciences	288130	Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP	Creative Biostructure	CBS-V700	human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X	Fisher Bioreagents	BP665	Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	S10467	Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Used for media preparation
Tryptone	Oxoid	LP0042	Used for media preparation
Tube Revolver	ThermoFisher Scientific	88881001	Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract	BD Biosciences	212750	Used for media preparation