フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化
Summary
このプロトコルの目的は、ヒトノロウイルスの真核生物病原体の細菌への結合を定量化することです。初期のウイルス-細菌付着アッセイを行った後、フローサイトメトリーは、集団内のウイルス結合細菌を検出するために使用される。
Abstract
コメンサルバクテリアは、真核生物ウイルスの感染に影響を与えるために十分に確立されています。病原体と宿主微生物叢との間の直接結合は、これらのウイルスの多くについて感染を改変する原因である。このように、ウイルス-バクテリア結合の性質を特徴付けるのは、細菌がウイルス感染を変えるメカニズムを解明するために必要な基礎的なステップである。ヒトノロウイルスの場合、コメンサルバクテリアはB細胞感染を増強する。ウイルスは、これらの細菌に直接結合し、この直接相互作用が感染増強のメカニズムに関与していることを示す。放射性標識ウイルスおよびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のシンチレーションカウントを含む細菌とウイルスとの相互作用を定量化するために、様々な技術を使用することができます。どちらの方法も生きたウイルスの使用を必要とし、実験室で生成する必要があります。現在、ヒトノロウイルスに利用可能な確立されたインビトロ培養システムは、高濃度ウイルスストックの生成を可能にするのに十分な堅牢性を持っていません。生きたウイルスの代わりに、ノロウイルスと細菌の相互作用を特徴付けるためにウイルス様粒子(VLPs)が使用されてきました。ここでフローサイトメトリー法は、グラム陰性およびグラム陽性菌に対するVLP結合を定量するウイルス特異的抗体を用いて記載される。試験した細菌へのVLP結合の背景抗体結合および正確な定量化を減少させるアッセイの最適化のために、細菌のみ及びアイソタイプ制御の両方を含む。VLP:細菌比率が高いと、VLPは細菌集団の大部分に結合する。しかし、VLP量が減少すると、結合する細菌の割合も減少します。最終的に、この方法は、ノロウイルスを調節する特定の条件および構造成分を解明する将来の実験で使用することができる:細菌相互作用。
Introduction
ヒトノロウイルス(HuNovs)は、世界中の胃腸疾患の主な原因であり、毎年6億8,500万人の感染症と20万人以上の死亡を引き起こします。他の腸内ウイルスと同様に、この病原体の感染を増強するとともに、その代理ウイルスであるマウスノロウイルス22,33の感染を増強することが示されている。また、細菌がヒトノ,ロウイルス4、5、65による感染4を阻害する可能性があるという矛盾する報告もある。6いくつかのウイルスに対して、ウイルスと細菌の直接相互作用は、ウイルス感染22、7、8、9、107,8,9に影響を与えるメカニズムの根源であるように見え、10ヒトノロウイルスが細菌11、12,12の表面に直接結合することが電子顕微鏡によって示されている。したがって、これらの相互作用を特徴付けるのは、細菌がウイルス感染に影響を与えるメカニズムを決定する上で重要になってきました。この特性評価は、古典的に、宿,主微生物叢7、12、1312の構成要素である細菌種の配列に対7するウイルス結合を定量化することで始まった。これらの付着アッセイは、細菌に結合するウイルスの量を明らかにするだけでなく、この相互作用がウイルスの適性および生存に及ぼす影響を決定するのに役立ちます。
ウイルスの付着を定量するために、伝統的に採用される方法としては、ウイルスゲノム12または放射性標識ウイルスの生成を定量するPCRベースのアッセイと、ウイルス粒子7、8、9、138,9を定量するためのシンチ7レーションカウントの使用が含まれる。,13これらの方法を使用するには、一般的に高い刺激性ウイルス株へのアクセスとそれらを生成するためのインビトロ栽培技術が必要です。ヒトノロウイルス用の培養システムは22、14、1514に存在するが、15ヒトノロウイルス/細菌相互作用を定量化するためにPCRおよびシンチレーションカウントの使用を制限または排除するこれらの高濃度のストックを生成するために必要な堅牢な複製をサポートするものはない。
この問題を回避するために、ウイルス様粒子(VLPs)は、ヒトノロウイルスと細菌16、17,17との相互作用を調査するために生きたウイルスの代理として使用することができる。Vlps は、派生元のウイルスによく似た非感染性の粒子です。ヒトノロウイルスの場合、これらの粒子はVP1(そしていつかVP2)タンパク質の発現から生成され、遺伝物質を欠いた無傷のウイルスキャプシド(すなわち、ノロウイルスのRNA)を作成するために自己集合する。これらのVLPは、よく特徴付けられており、それらが由来する野生型ウイルスに構造的および抗原的に類似している18、19、20、21、22、23。18,19,20,21,22,23したがって、VLPは、ヒトノロウイルスとコメンサルバクテリアの表面相互作用を調べるための理想的な代理として機能します。VLPには遺伝物質が欠けているため、PCRベースのアッセイはウイルス結合の定量化には使用できません。抗体ベースのフローサイトメトリー法は、先に説明したものであり、半定量的に16の方法で細菌に結合する低レベルのVLPを検出することができる。この方法は、グラム陰性およびグラム陽性の共生菌16の両方に結合するヒトノロウイルスVLPの正確な定量を可能にするように最適化された。
Protocol
Representative Results
Discussion
腸内ウイルスの細菌への結合を定量化する能力は、これらの細菌がウイルス感染を変化させるメカニズムを解明するための重要な第一歩である。本明細書に記載されている方法は、E.クロアカエ(グラム陰性細菌)およびL.ガッセリ(グラム陽性細菌)の両方とのヒトノロウイルスVLP相互作用を測定するために最適化されているが、目的の任意の哺乳類ウイル?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、Sutouka Bharとシャネルモスビー・ハウンドアップが書かれた原稿の批判的なレビューをしてくれたことに感謝し、アルフォンソ・カリージョは細菌の標準的な曲線を生成するための支援を受けました。この研究は、国立衛生研究所(R21AI140012)からの助成金とフロリダ大学食品農業科学研究所からの種子助成金によって部分的に資金提供されています。
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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