유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화
Summary
이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.
Abstract
생균은 진핵 바이러스의 감염에 영향을 미치기 위하여 잘 설치됩니다. 병원체와 숙주 미생물군유전체 사이의 직접 결합은 이러한 바이러스의 많은 감염을 변경하는 책임이 있다. 따라서, 바이러스-박테리아 결합의 특성화는 박테리아가 바이러스 감염을 변화시키는 메커니즘(들)을 해명하는 데 필요한 기초 단계이다. 인간 노로 바이러스에 대 한, 연구용 박테리아 B 세포 감염을 향상. 바이러스는 직접 이러한 박테리아에 바인딩, 이 직접 적인 상호 작용 감염 향상의 메커니즘에 관여 하는 것을 나타내는. 방사성 표지된 바이러스 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주식 계수를 포함하여 박테리아와 바이러스 간의 상호 작용을 정량화하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 두 방법 모두 실험실에서 생성해야 할 수도 있는 살아있는 바이러스의 사용을 필요로 합니다. 현재, 인간 노로바이러스에 사용할 수 있는 체외 배양 시스템 중 어느 것도 고농축 바이러스 성 주식의 생성을 허용할 만큼 충분히 견고하지 않다. 살아있는 바이러스 대신에, 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 노로바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 본 명세서에서 유동 세포분석 방법은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 VLP 결합을 정량화하기 위해 바이러스 특이적 항체를 사용하여 기술된다. 박테리아 만 및 이소형 대조군 모두의 포함은 시험된 박테리아에 대한 VLP 부착의 배경 항체 결합 및 정확한 정량화를 감소시키기 위해 분석법의 최적화를 허용하였다. 높은 VLP: 박테리아 비율은 세균 인구의 큰 비율에 결합하는 VLPs 귀착됩니다. 그러나, VLP 수량 감소 하는 경우, 결합 하는 박테리아의 백분율 또한 감소. 궁극적으로, 이 방법은 노로바이러스:세균 상호 작용을 조절하는 특정 조건 및 구조적 구성 요소를 해명하는 향후 실험에 사용될 수 있다.
Introduction
인간 노로바이러스(HuNoVs)는 전 세계적으로 위장병의 주요 원인으로,매년6억 8,500만 건의 감염과 200,000명 이상의 사망을 초래합니다. 다른 장내 바이러스와 마찬가지로, 동보 박테리아의 존재는 이 병원체뿐만 아니라 대리 바이러스, 뮤린 노로바이러스2,,3의감염을 향상시키는 것으로 나타났다. 박테리아가 인간 노로 바이러스4,,5,,6에의한 감염을 억제 할 수 있다는 충돌보고서가 있습니다. 여러 바이러스의 경우, 바이러스와 박테리아 간의 직접적인 상호작용은 바이러스감염에영향을 미치는 메커니즘의 근간을 이룬 것으로 나타나며2,7,,8,,9,,10,전자 현미경을 통해 인간 노로바이러스가 박테리아11,,12의표면에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 그러므로, 이 상호 작용을 특성화하는 것은 박테리아가 바이러스성 감염에 영향을 미치는 기계장치를 결정하는 것이 중요하게 되었습니다. 이러한 특성화는 숙주 미생물군유전체7,,12,,13의성분인 세균종의 배열에 대한 바이러스 결합을 정량화하는 것으로 고전적으로 시작되었다. 이 첨부 성 분석은 박테리아에 묶인 바이러스의 양을 밝힐 뿐만 아니라 바이러스 적합성 및 생존에 이 상호 작용의 충격을 결정하는 것을 돕습니다.
바이러스 부착을 정량화하기 위해, 전통적으로 채택된 방법은 바이러스 게놈12 또는 방사성 표지된 바이러스의 생성을 정량화하는 PCR 기반 측정법을 포함하고 있으며, 바이러스입자를정량화하기 위해 분신계계의 사용7,8,,9,,13. 이러한 방법의 사용은 일반적으로 높은 티터 바이러스 주식과 그들을 생성하는 시험관 내 재배 기술에 대한 액세스를 필요로한다. 인간 노로 바이러스에 대한 여러 배양 시스템은 지금 존재하지만2,,14,15,아무도 제한하거나 인간의 노로 바이러스 / 세균 상호 작용을 정량화하기 위해 PCR 및 종축 계수의 사용을 제거 이러한 고농축 주식을 생성하는 데 필요한 강력한 복제를 지원하지 않습니다.14
이 문제를 우회하기 위해, 바이러스 유사 입자(VLPs)는 인간 노로바이러스와박테리아(16,,17)사이의 상호작용을 조사하기 위해 바이러스를 살리기 위해 대리로 사용될 수 있다. VLPs는 밀접하게 그(것)들이 파생되는 바이러스를 닮은 비 감염성 입자입니다. 인간 노로바이러스의 경우, 이들 입자는 유전물질이 결여된 손상되지 않은 바이러스 성 캡시드(즉, 노로바이러스를 위한 RNA)를 만들기 위해 자가 조립하는 VP1(및 언젠가 VP2) 단백질의 발현으로부터 생성된다. 이들 VLP는 잘 특징지어지고 있으며, 구조적으로 그리고 항원적으로 유사하며, 이들은,18,19,,20,,21,,22,,23에서유래되는 야생형 바이러스와 유사하다. 따라서, VLP는 인간 노로바이러스와 공생 박테리아 사이의 표면 상호 작용을 조사하기위한 이상적인 대리역할을합니다. VLPs는 유전 물질이 부족하다는 것을 감안할 때, PCR 기지를 둔 세포는 바이러스성 결합을 정량화하기 위하여 이용될 수 없습니다. 항체 기반 유동 세포분석 방법은 이전에 설명되었고 반정량적인 방식으로 박테리아에 결합하는 낮은 수준의 VLP를 검출할 수있었다 16. 이 방법은 그람 음성 및 그람 양성 공생박테리아(16)에결합하는 인간 노로바이러스 VLP의 정확한 정량화를 허용하도록 최적화되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
박테리아에 장바이러스의 결합을 정량화하는 기능은 이 박테리아가 바이러스성 감염을 바꾸는 기계장치를 해명하기 위한 중요한 첫번째 단계입니다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 노로바이러스 VLP 상호작용을 E. 클로아카(gram-negative 박테리아) 및 L. gasseri(그람 양성 박테리아)와 측정하도록 최적화되었지만, 임의의 포유류 바이러스 및 관심 있는 박테리아…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
수토누카 바르와 샤넬 모스비-하운드루프가 작성된 원고에 대한 비판적 검토와 세균 표준 곡선 생성에 도움을 준 알폰소 카릴로에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에서 보조금에 의해 부분적으로 자금 (R21AI140012) 플로리다 대학에서 종자 보조금에 의해, 식품 및 농업 과학 연구소.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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