Kvantifiera Human Norovirus Virus-liknande partiklar bindning till commensal bakterier med hjälp av flow cytometri
Summary
Målet med detta protokoll är att kvantifiera bindningen av eukaryota patogenen humant norovirus till bakterier. Efter att ha utfört en första virusbakterien fastsättningsanalys, flöde cytometri används för att upptäcka viralt bundna bakterier inom befolkningen.
Abstract
Commensal bakterier är väl etablerade för att påverka infektion av eukaryota virus. Direkt bindning mellan patogenen och värdmikrobiomet är ansvarig för att ändra infektion för många av dessa virus. Således, karakterisera arten av virus-bakterier bindande är ett grundläggande steg som behövs för att belysa den mekanism (er) genom vilken bakterier ändra virusinfektion. För humant norovirus, commensal bakterier förbättra B-cellinfektion. Viruset binder direkt till dessa bakterier, vilket tyder på att denna direkta interaktion är involverad i mekanismen för infektionsförbättring. En mängd olika tekniker kan användas för att kvantifiera interaktioner mellan bakterier och virus, inklusive scintillation räkna radiolabeled virus och polymeras kedjereaktion (PCR). Båda metoderna kräver användning av levande virus, som kan behöva genereras i laboratoriet. För närvarande är inget av de etablerade in vitro-odlingssystem som finns tillgängliga för humant norovirus tillräckligt robusta för att möjliggöra generering av starkt koncentrerade viruslager. I stället för levande virus har virusliknande partiklar (VLPs) använts för att karakterisera samspelet mellan norovirus och bakterier. Häri beskrivs en flödescytometrimetod med användningar av virusspecifika antikroppar för att kvantifiera VLP-bindning till gramnegativa och grampositiva bakterier. Införande av endast bakterier och isotypkontroller som är tillåtna för optimering av analysen för att minska bakgrundsantikroppsbindning och exakt kvantifiering av VLP-fastsättning på de testade bakterierna. Höga VLP:bakterieförhållanden resulterar i VLPs som binder till stora andelar av bakteriepopulationen. Men när VLP-mängder minskas minskar också andelen bakterier som är bundna. I slutändan kan denna metod användas i framtida experiment som belyser de specifika villkor och strukturella komponenter som reglerar norovirus:bakteriella interaktioner.
Introduction
Humana norovirus (HuNoVs) är den främsta orsaken till gastrointestinal sjukdom över hela världen, som ansvarar för 685 miljoner infektioner och över 200.000 dödsfall varje år1. Som med andra enteriska virus, förekomsten av commensal bakterier har visat sig öka infektion av denna patogen samt dess surrogatvirus, murine norovirus2,3. Det finns också motstridiga rapporter om att bakterier kan hämma infektion av humant norovirus4,,5,6. För flera virus verkar direkt interaktion mellan viruset och bakterier ligga bakom de mekanismer som påverkar virusinfektion2,7,8,9,10, och det har visats genom elektronmikroskopi att humana norovirus binder direkt till ytan av bakterier11,12. Därför har karakterisering av dessa interaktioner blivit avgörande för att bestämma de mekanismer genom vilka bakterier påverkar virusinfektion. Denna karakterisering har klassiskt börjat med att kvantifiera viral bindning till en rad bakteriearter som är komponenter i värdmikrobiomet7,,12,13. Dessa bifogad fil analyser inte bara avslöja mängden virus bunden till bakterier, men också stöd för att fastställa effekterna av denna interaktion på viral kondition och överlevnad.
För att kvantifiera viral kvarstad, traditionellt använda metoder inkluderar PCR-baserade analyser som kvantifierar virala genom12 eller generering av radioaktivt märkt virus och användning av scintillation räkna för att kvantifiera viruspartiklar7,8,9,13. Användningen av dessa metoder kräver i allmänhet tillgång till högiterviruslager och in vitro-odlingstekniker för att generera dem. Medan flera kultursystem för humant norovirus nu finns2,14,15, stöder ingen den robusta replikering som krävs för att generera dessa starkt koncentrerade bestånd som begränsar eller eliminerar användningen av PCR och scintillation räkna för att kvantifiera humant norovirus /bakteriella interaktioner.
För att kringgå detta problem, virusliknande partiklar (VLPs) kan användas som ett surrogat för att leva virus för att undersöka interaktioner mellan mänskliga norovirus och bakterier16,17. Vlps är icke-infektiösa partiklar som liknar det virus som de härrör från. När det gäller humant norovirus genereras dessa partiklar från uttrycket av VP1 -proteinet (och någon gång VP2)-proteinet, som självmonterar för att skapa intakta viruskapsider som saknar genetiskt material (dvs. RNA för norovirus). Dessa VLPs har väl karakteriserats, är strukturellt och antigeniskt liknar de vilda virus från vilka de härstammar18,19,20,21,22,23. Därför fungerar VLPs som ett idealiskt surrogat för att undersöka ytan interaktioner mellan mänskliga norovirus och commensal bakterier. Med tanke på att VLPs saknar genetiskt material kan PCR-baserade analyser inte användas för att kvantifiera virusbindning. En antikroppsbaserad flödescytometrimetod har tidigare beskrivits och kan detektera låga nivåer av VLP-bindning till bakterier på ett semikvantativt sätt16. Denna metod har optimerats för att möjliggöra exakt kvantifiering av humant norovirus VLP bindning till både gramnegativa och grampositiva commensalbakterier16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förmågan att kvantifiera bindning av enteriska virus till bakterier är ett kritiskt första steg för att belysa de mekanismer genom vilka dessa bakterier förändrar virusinfektion. De metoder som beskrivs häri har optimerats för att mäta humant norovirus VLP interaktioner med både E. cloacae (gramnegativa bakterien) och L. gasseri (en grampositiv bakterie), men kan anpassas för användning med alla däggdjursvirus och bakterie av intresse. Medan VLPs är ett id…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Sutonuka Bhar och Chanel Mosby-Haundrup för deras kritiska granskning av det skriftliga manuskriptet, liksom Alfonso Carrillo för hjälp med att generera bakteriella standardkurvor. Detta arbete finansieras delvis av ett bidrag från National Institute of Health (R21AI140012) och av ett frö bidrag från University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
Referências
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
