在西图化学分析中，以检验水生生态系统中的微生物行为
Summary
这里介绍的是原位化疗的规程，这是一种最近开发的微流体装置，能够直接研究环境中的微生物行为。
Abstract
微生物行为，如运动和化学（细胞改变其运动的能力，以响应化学梯度），在细菌和古生物领域广泛。在异构环境中，Chemotaxis 可产生巨大的资源获取优势。它还在共生相互作用、疾病和全球过程（如生物地球化学循环）中发挥关键作用。然而，目前的技术将化疗研究限制在实验室，并不容易应用于该领域。此处介绍的是部署原位化学测定 （ISCA） 的分步协议，该装置可直接在自然环境中对微生物化疗进行强健的检测。ISCA 是一种微流体装置，由 20 井阵列组成，可装载感兴趣的化学品。一旦部署在水环境中，化学物质会从水井中扩散出来，产生微生物通过化疗游入水井来感知和响应的浓度梯度。然后，可以对井内物质进行采样，并用于（1） 通过流式细胞学量化对特定化合物的化疗反应强度，（2） 分离和培养反应灵敏的微生物，（3） 通过分子技术描述反应群体的身份和基因组潜力。ISCA 是一个灵活的平台，可部署在水相的任何系统中，包括海洋、淡水和土壤环境。
Introduction
不同的微生物利用动力和化学利用来利用零碎的营养环境，寻找宿主，或避免有害条件1,1，2，3。,3这些微生物行为反过来又会影响化学转化率4，并促进陆地、淡水和海洋生态系统2、5的共生伙伴关系。
在过去的60年里，切莫塔西在实验室条件下进行了广泛的研究。研究化疗的第一个定量方法，毛细管测定，涉及一个毛细管充满了悬浮在细菌6的悬浮液中。从管子中扩散出的化学物质会产生化学梯度，而化学细菌通过迁移到管7来响应这种梯度。自毛细管测定开发以来，目前仍然广泛使用，在日益受控的物理/化学条件下，还开发了许多其他技术来研究化学化学，最近涉及使用微流体8、9、10。,9,10
微流体与高速视频显微镜一起，能够跟踪单个细胞的行为，以响应精心控制的梯度。虽然这些技术极大地提高了我们对化疗的了解，但它们仅限于实验室使用，不容易转化为环境系统中的实地部署。因此，没有检查细菌自然群落在自然生态系统内使用化学药物的能力;因此，目前对化疗的潜在生态重要性的理解偏向于人工实验室条件和数量有限的实验室培养的细菌分离物。最近开发的 ISCA 克服了这些限制11。
ISCA以毛细管测定的一般原则为上;然而，它利用现代微制造技术，提供一个高度复制的、易于部署的实验平台，用于对自然环境中感兴趣的化合物进行化学化学的定量化。它还允许通过直接隔离或分子技术识别和鉴定化疗微生物。虽然第一个工作装置是玻璃和PDMS11自行制造和制造的，但最新的注塑成型版本由聚碳酸酯组成，采用高度标准化的制造程序（对于最新版本的装置感兴趣，可以联系相应的作者）。
ISCA 是信用卡大小的，由 20 口井组成，分布在 5 x 4 孔阵列中，每个井通过一个小端口（直径 800 μm）与外部水生环境相连; 图1）。装入井中的放药化疗物通过港口扩散到环境中，化疗微生物通过港口游入井中作出反应。由于许多因素会影响自然环境中的 ISCA 实验结果，因此此分步协议将帮助新用户克服潜在障碍并促进有效部署。
Protocol
Representative Results
Discussion
在水生微生物的规模上，环境远非同质，其特征往往是物理/化学梯度，这些梯度结构微生物群落1,1，15。动性微生物使用行为的能力（即化疗）有助于在这些异质微环境中觅食1。直接在环境中研究化学化学具有识别重要特异性相互作用和化学偏好的潜力，这可以帮助解开特定微生物对生物地球化学过程的贡献。提出的协议将 ISCA 部署?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究部分由戈登和贝蒂摩尔基金会海洋微生物学倡议资助，通过向J.R.S.和R.S.提供GBMF3801赠款， 向R.S.颁发调查员奖（GBMF3783），向J.B.R颁发澳大利亚研究理事会研究金（DE160100636），西蒙斯基金会向B.S.L.（594111.）颁发奖项，西蒙斯基金会（542395）向R.S.颁发资助，作为微生物生态系统原则（PriME）合作的一部分。
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
Referências
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