في الموقع Chemotaxis اختبار لفحص السلوك الميكروبي في النظم الإيكولوجية المائية
Summary
يُعرض هنا البروتوكول الخاص بـ اختبار كميكوتاكس في الموقع، وهو جهاز microfluidic تم تطويره مؤخرًا ويمكّن من إجراء دراسات للسلوك الميكروبي مباشرة في البيئة.
Abstract
السلوكيات الميكروبية، مثل حركية وchemotaxis (قدرة الخلية على تغيير حركتها استجابة للتدرج الكيميائي)، تنتشر على نطاق واسع عبر المجالات البكتيرية والعتقية. يمكن أن ينتج عن Chemotaxis مزايا كبيرة في الحصول على الموارد في بيئات غير متجانسة. كما تلعب دوراً حاسماً في التفاعلات التكافلية، والمرض، والعمليات العالمية، مثل الدراجات الكيميائية الحيوية. ومع ذلك، فإن التقنيات الحالية تقيد بحوث الchemotaxis بالمختبر ولا يمكن تطبيقها بسهولة في هذا المجال. يُعرض هنا بروتوكول خطوة بخطوة لنشر مقايسة الأوموتاكسيس في الموقع (ISCA)، وهو جهاز يمكّن من الاستجواب القوي لخموتاكسيس الميكروبات مباشرة في البيئة الطبيعية. وICCA هو جهاز microfluidic تتكون من مجموعة 20 بئر، والتي يمكن تحميل المواد الكيميائية ذات الأهمية. وبمجرد نشرها في بيئات مائيّة، تنتشر المواد الكيميائية خارج الآبار، مما يخلق تدرجات تركيز تستشعرها الميكروبات وتستجيب لها بالسباحة في الآبار عبر الآبار. ويمكن بعد ذلك أخذ عينات من محتويات البئر واستخدامها في (1) قياس قوة الاستجابات الكيميائية لمركبات محددة من خلال قياس الخلايا المتدفقة، (2) عزل الكائنات الدقيقة المتجاوبة وثقافتها، (3) توصيف هوية السكان المستجيبين وإمكاناتهم الجينية من خلال التقنيات الجزيئية. و ISCA هو منصة مرنة يمكن نشرها في أي نظام مع مرحلة مائي، بما في ذلك البيئة البحرية والمياه العذبة والتربة.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة المتنوعة استخدام الحركة وchemotaxis لاستغلال البيئات غير مكتمل المغذيات، والعثور على المضيفين، أو تجنب الظروف الضارة1،2،3. ويمكن أن تؤثر هذه السلوكيات الميكروبية بدورها على معدلات التحول الكيميائي4 وأن تعزز الشراكات التكافلية عبر النظم الإيكولوجية الأرضية والمياه العذبة والنظم الإيكولوجية البحرية2،5.
وقد درست على نطاق واسع Chemotaxis تحت ظروف المختبرات على مدى السنوات ال 60 الماضية6. الطريقة الكمية الأولى لدراسة chemotaxis ، المقايسة الشعرية ، ينطوي على أنبوب شعري مملوءة بكيموااتtractant المفترضة مغمورة في تعليق البكتيريا6. نشر المادة الكيميائية من الأنبوب يخلق تدرج كيميائي، والبكتيريا الكيميائية تستجيب لهذا التدرج عن طريق الهجرة إلى الأنبوب7. منذ تطور المقايسة الشعرية ، لا تزال تستخدم على نطاق واسع اليوم ، وقد تم تطوير العديد من التقنيات الأخرى لدراسة chemotaxis تحت ظروف فيزيائية / كيميائية تسيطر عليها بشكل متزايد ، مع أحدثها التي تنطوي على استخدام microfluidics8،9،10.
Microfluidics، جنبا إلى جنب مع المجهر الفيديو عالية السرعة، تمكن من تتبع سلوك الخلايا الفردية استجابة لتدرجات تسيطر عليها بعناية. وعلى الرغم من أن هذه التقنيات قد حسنت إلى حد كبير فهمنا لخموتاكسيس، إلا أنها اقتصرت على الاستخدام المختبري ولا تترجم بسهولة إلى النشر الميداني في النظم البيئية. ونتيجة لذلك، لم يتم فحص قدرة المجتمعات الطبيعية من البكتيريا على استخدام البكيميوتاكسيس داخل النظم الإيكولوجية الطبيعية؛ وهكذا، فإن الفهم الحالي للأهمية البيئية المحتملة لخميموتاكسيس منحاز لظروف المختبر الاصطناعي وعدد محدود من عزل البكتيريا المستزرعة في المختبرات. وSCA وضعت مؤخرا يتغلب على هذه القيود11.
وSCA يبني على المبدأ العام من المقايسة الشعرية; ومع ذلك، فإنه يجعل من استخدام تقنيات microfabrication الحديثة لتقديم منصة تجريبية منسوخة للغاية، يمكن الانتشار بسهولة لتحديد كمي من chemotaxis نحو مركبات ذات فائدة في البيئة الطبيعية. كما يسمح بتحديد وتوصيف الكائنات الحية الدقيقة الكيميائية عن طريق العزل المباشر أو التقنيات الجزيئية. في حين أن أول جهاز عمل كان ذاتي التصنيع وشيد من الزجاج و PDMS11، فإن أحدث نسخة مصبوب حقن يتكون من البولي ، وذلك باستخدام إجراء تصنيع موحدة للغاية (لمصلحة في أحدث إصدار من الجهاز ، يمكن الاتصال المؤلفين المقابلة).
وتتميز هذه الآبار بحجم بطاقة الائتمان، وتتألف من 20 بئراً موزعة في صفيف آبار 5 × 4، يرتبط كل منها بالبيئة المائية الخارجية بواسطة ميناء صغير (قطره 800 ميكرومتر؛ و20 بئراً من الآبار، و 400 ميكرومتر، و100 ميكرومتر، و100 100 متر، و100 ميكرو متر، و100 100 متر، و150 ميكرو، و1000 ميكرو، و1999، و1999،100 متر مربع، و 2000 متر مربع، و 100 ميكرومتر، و 100 الشكل 1). المواد الكيميائية المفترضة المحملة في الآبار تنتشر في البيئة عبر الميناء ، والميكروبات الكيميائية تستجيب عن طريق السباحة من خلال الميناء في البئر. وبما أن العديد من العوامل يمكن أن تؤثر على نتائج تجربة ISCA في البيئة الطبيعية، فإن هذا البروتوكول خطوة بخطوة سوف يساعد المستخدمين الجدد على التغلب على العقبات المحتملة وتسهيل عمليات النشر الفعالة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على نطاق الكائنات الحية الدقيقة المائية، والبيئة بعيدة كل البعد عن التجانس وغالبا ما تتميز بالتدرجات الفيزيائية/الكيميائية التي تُهيّن المجتمعات الميكروبية1،,15. قدرة الكائنات الحية الدقيقة motile على استخدام السلوك (أي chemotaxis) يسهل الأعلاف داخل هذه البيئة ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل مبادرة الأحياء الدقيقة البحرية مؤسسة غوردون وبيتي مور، من خلال منحة GBMF3801 إلى J.R.S. وR.S.، وجائزة المحقق (GBMF3783) إلى R.S.، فضلا عن زمالة مجلس البحوث الأسترالي (DE160100636) إلى J.B.R. ، وهي جائزة من مؤسسة سيمونز إلى B.S.L. (594111) ، ومنحة من مؤسسة سيمونز (542395) إلى R.S. كجزء من مبادئ النظم الإيكولوجية الميكروبية (PriME) التعاونية.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
Referências
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
