Nous présentons un modèle de maladie cardiaque ischémique utilisant des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, avec une méthode pour l’évaluation quantitative des dommages tissulaires causés par l’ischémie. Ce modèle peut fournir une plate-forme utile pour le dépistage des médicaments et la recherche sur les maladies cardiaques ischémiques.
La cardiopathie ischémique est une cause importante de décès dans le monde entier. Il a donc fait l’objet d’une énorme quantité de recherches, souvent avec des modèles de petits animaux tels que les rongeurs. Cependant, la physiologie du cœur humain diffère considérablement de celle du cœur des rongeurs, soulignant la nécessité de modèles cliniquement pertinents pour étudier les maladies cardiaques. Ici, nous présentons un protocole pour modéliser la maladie cardiaque ischémique utilisant des cardiomyocytes différenciés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS-CM) et pour quantifier les dommages et l’affaiblissement fonctionnel des cardiomyocytes ischémiques. L’exposition à 2% d’oxygène sans glucose et sérum augmente le pourcentage de cellules blessées, ce qui est indiqué par la coloration du noyau avec l’iodure de propidium, et diminue la viabilité cellulaire. Ces conditions diminuent également la contractilité des hiPS-CM comme confirmée par l’analyse de champ vectoriel de déplacement des images vidéo microscopiques. Ce protocole peut en outre fournir une méthode pratique pour le dépistage personnalisé des médicaments en facilitant l’utilisation de cellules hiPS de patients individuels. Par conséquent, ce modèle de cardiopathie ischémique, basé sur iPS-CMs d’origine humaine, peut fournir une plate-forme utile pour le dépistage des médicaments et la poursuite de la recherche sur les maladies cardiaques ischémiques.
La cardiopathie ischémique (IHD) est reconnue dans le monde entier comme la principale cause de décès, et on estime qu’elle est responsable de plus de neuf millions de décès en 20161. La prévalence des maladies cardiovasculaires continue d’augmenter, et la mondialisation semble avoir contribué à la prévalence des facteurs de risque de maladies cardiaques dans les pays en développement. Par conséquent, l’étude de l’IHD devient de plus en plus urgente2.
Les modèles expérimentaux des maladies cardiovasculaires sont essentiels pour étudier les mécanismes de la maladie, l’exactitude du diagnostic et le développement de nouvelles thérapies. Plusieurs modèles expérimentaux ont été proposés par de nombreux laboratoires. Il est de la plus haute importance de choisir un modèle avec des avantages significatifs; la faisabilité, la répétabilité et la similitude avec les maladies humaines sont des facteurs clés dans la sélection des modèles de maladies cardiovasculaires3. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) porteuses de mutations spécifiques associées à la cardiomyopathie sont une alternative prometteuse aux modèles animaux4. Bien que de nombreuses stratégies ont été décrites pour induire des cardiomyocytes à l’aide d’iPSCs5,6,7,8,9, ici nous fournissons une méthode simple pour produire un modèle IHD en utilisant des cardiomyocytes différenciés des hiPSCs, dans lequel la sélection laborieuse de cardiomyocyte utilisant des marqueurs n’est pas appliquée. Dans cette méthode, les cardiomyocytes sont sélectionnés fonctionnellement en analysant la contraction spontanée.
L’induction des cardiomyocytes utilisant hiPSC évite le sacrifice animal et la chirurgie techniquement difficile. L’établissement de modèles animaux de l’IHD nécessite des techniques chirurgicales difficiles10. Il est presque impossible de simuler parfaitement les divers aspects pathophysiologiques des maladies cardiaques humaines, tels que la fréquence cardiaque et les potentiels d’action de la physiologie des rongeurs. Couplé à la moralité et à l’éthique de l’utilisation de modèles animaux, le développement de nouveaux modèles expérimentaux autres que les modèles animaux est impératif. Les cardiomyocytes différenciés des cellules iPS humaines imitent mieux l’état physiologique du coeur humain. Dans ce protocole, nous établissons un modèle d’IHD utilisant des cardiomyocytes dérivés des cellules hiPS (hiPS-CM). Dans notre modèle, la privation d’oxygène et de glucose conduit à une diminution de la force contractile et la viabilité des hiPS-CM. Notre méthode fournit une nouvelle approche pour le modèle IHD et démontre une nouvelle plate-forme pour l’étude de cette maladie.
Les chercheurs utilisent souvent des modèles de laboratoire pour les petits animaux pour mener des expériences sur l’IHD. Ici, nous avons développé un modèle de culture cellulaire de l’IHD humain pour mener de telles expériences.
Le principal problème auquel un utilisateur de ce protocole peut faire face est le faible taux de cardiomyocytes différenciés. Plusieurs mesures doivent être prises avec grand soin pour améliorer le taux de différenciation réussie : a) être doux lors du pipetage parce que les cellules se détachent facilement après l’addition des enzymes de dissociation cellulaire réactif, (b) ajoutant Y-27632 augmente le taux de survie des cellules iPS lors du détanage, et (c) le moment des changements moyens au début de la différenciation devrait être précisément 48 h d’intervalle pour assurer l’expression contrôlée des gènes impliqués dans la différenciation.
En ce qui concerne les protéines de matrice extracellulaire utilisées pour recouvrir la surface de la plaque de culture, d’autres matériaux que laminine que nous avons utilisés dans ce protocole peuvent être utilisés. Par exemple, Matrigel14,15, et gélatine 16,17sont utilisés pour la culture d’entretien sans alimentation des hiPSCs.17 Selon Haraguchi et coll., les hiPSC ensemencés sur Matrigel ont été différenciés avec succès en feuille de cellules cardiaques18.
Il existe un certain nombre d’études précédentes concernant les modèles de culture pour la modélisation des maladies à l’aide de cardiomyocytes dérivés de hiPSCs. En ce qui concerne la modélisation des lésions de l’ischémie-reperfusion, des manipulations de l’environnement cellulaire, telles que l’hyperkaliémie, l’acidose et l’accumulation de lactate, ont été introduites19. D’autres méthodes incluent le granulé cellulaire pour entraver la diffusion de l’oxygène20 et l’inhibition métabolique utilisant le cyanure21. Dans le protocole actuel, les lésions cellulaires ont été obtenues par une méthode relativement simple, à savoir la privation de 24 h d’oxygène et de nutriments. Cependant, il faut prendre soin d’examiner les processus pathophysiologiques précis de la maladie cardiaque ischémique, car il y a effectivement des différences entre la maladie in vivo et le modèle de la maladie du protocole actuel, comme la présence ou l’absence d’environnement cellulaire tridimensionnel et le sang.
En ce qui concerne l’aspect technologique de l’évaluation de la fonction cardiomyocyte, Toepfer et coll. ont signalé un algorithme basé sur MatLab pour déterminer la contraction et la relaxation du sarcomère dans les hiPS-CM22. Smith et coll. ont signalé une méthode avancée d’analyse électrophysiologique à haut débit des cellules excitables dérivées de hiPS-CM, à l’aide de tableaux multiélectrodes sophistiqués à motifs nanotopographiques23,24. L’avantage de notre protocole est qu’il ne nécessite que des logiciels et des consommables conventionnels, tels que le logiciel imageJ et des plaques de 96 puits.
En ce qui concerne le niveau d’oxygène dans le cœur, la pression d’oxygène dans les veines qui atteignent le cœur est pensé pour être 40 mmHg25. Selon McDougal et coll., la pression d’oxygène extracellulaire sous hypoxie est estimée à 12,8 mmHg26. En appliquant la méthode de Rounds et al.27, la pression d’oxygène dans le milieu de culture (salinité: 35‰) sous l’état hypoxique (2% d’oxygène) à 37 °C traités avec le protocole actuel est calculée à 14,9 mmHg, ce qui est supérieur à l’estimation ci-dessus. Fait intéressant, Al-Anis et coll. ont signalé qu’il y a un gradient de pression d’oxygène dans le milieu de culture, et que la pression d’oxygène est affectée par le type de cellule, la densité d’ensemencement et le volume moyen28. Typiquement, la concentration d’oxygène au bas de la plaque de culture où les cellules résident est la plus faible. Par conséquent, l’effet de la profondeur dans le milieu de culture réduirait encore la pression efficace d’oxygène près de hiPS-CM. Afin d’induire des dommages suffisants aux hiPS-CM en utilisant l’état hypoxique, une attention particulière doit être accordée à la profondeur du milieu et à la densité des cellules.
Notre modèle hiPS-CM, qui est très proche des conditions physiologiques des myocytes cardiaques humains, imite avantageusement l’IHD humain. Les approches fondées sur des modèles animaux comprennent des questions éthiques, techniques et académiques. En particulier, les modèles in vivo nécessitent une technique avancée de microchirurgie pour obtenir des données reproductibles : par exemple, l’occlusion de la branche descendante antérieure de l’artère coronaire gauche chez les rongeurs3. Le modèle hiPS-CM décrit ci-après surmonte ces barrières critiques et fournit une plate-forme utile, pertinente et répétable pour les maladies cardiovasculaires.
Toutefois, certaines limitations doivent être notées. Une différence évidente entre les cardiomyocytes iPS-induits et les cardiomyocytes normaux est l’absence de T-tubules29, et nous n’avons pas inclus des facteurs humoristiques tels que les dommages tissulaires induits par les leucocytes et l’activation d’un système de complément dans notre étude. En outre, le taux de cardiomyocytes différenciés dans ce modèle (20,7 ± 9,6 %, figure supplémentaire 3)devrait être amélioré. La publication récente de Halloin et coll. décrit une méthode évolutive et définie chimiquement pour induire la pureté hiPS-CM de >95% par les modulateurs chimiques de voie WNT sans exigence d’aucune sélection par les marqueurs30. Néanmoins, notre modèle d’IHD humain est relativement simple et cliniquement applicable (p. ex., dépistage médicamenteux utilisant des cellules iPS dérivées par le patient). Notre modèle est également une plate-forme unique pour élucider davantage les mécanismes sous-jacents IHDs.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Les auteurs remercient le Laboratoire central de recherche de l’Okayama University Medical School pour l’aide du FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |