JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Neurociência

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Published: June 13, 2020
doi:
10.3791/61113
, , ,
1Department of Radiology,University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology,University of Alabama at Birmingham

Summary

Ultrassom focado com agentes de microbolhas pode abrir a barreira cerebral sanguínea de forma focal e transitória. Esta técnica tem sido usada para fornecer uma ampla gama de agentes através da barreira cerebral do sangue. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a entrega localizada ao cérebro de roedores com ou sem orientação de ressonância magnética.

Abstract

Cirurgia estereotaxica é o padrão ouro para a droga localizada e a entrega de genes para o cérebro de roedores. Essa técnica tem muitas vantagens sobre a entrega sistêmica, incluindo localização precisa para uma região cerebral alvo e redução de efeitos colaterais fora do alvo. No entanto, a cirurgia estereotaxa é altamente invasiva, o que limita sua eficácia translacional, requer longos tempos de recuperação e oferece desafios ao atingir múltiplas regiões cerebrais. O ultrassom focado (FUS) pode ser usado em combinação com microbolhas circulantes para abrir transitoriamente a barreira cerebral do sangue (BBB) em regiões de tamanho milímetro. Isso permite a localização intracraniana de agentes entregues sistematicamente que normalmente não conseguem atravessar o BBB. Esta técnica fornece uma alternativa não invasiva à cirurgia estereotaxa. No entanto, até o momento, essa técnica ainda não foi amplamente adotada em laboratórios de neurociência devido ao acesso limitado a equipamentos e métodos padronizados. O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB (BBBO) que seja acessível e reproduzível e, portanto, possa ser facilmente adotada por qualquer laboratório.

Introduction

Apesar das muitas descobertas na neurociência básica, o número de tratamentos emergentes para distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos permanece relativamente limitado1,2. Uma compreensão mais profunda dos genes, moléculas e circuitos celulares envolvidos em distúrbios neurológicos tem sugerido tratamentos promissores irrealizáveis em humanos com técnicas atuais3. Tratamentos eficazes são muitas vezes limitados pela necessidade de ser penetrável cerebral e específico do local4,5,6,7,8. No entanto, os métodos existentes de entrega de medicamentos localizados para regiões cerebrais específicas (por exemplo, entrega via injeção ou cânula) são invasivos e requerem uma abertura a ser feita no crânio9. A invasividade desta cirurgia impede o uso rotineiro do parto localizado no cérebro humano. Além disso, os danos teciduais e as respostas inflamatórias resultantes são confundimentos onipresentes para estudos básicos e pré-clínicos que dependem da injeção intracerebral10. A capacidade de fornecer agentes não invasivamente através da barreira cerebral sanguínea (BBB) e direcioná-los para regiões cerebrais específicas pode ter um tremendo impacto nos tratamentos para distúrbios neurológicos, ao mesmo tempo em que fornece uma poderosa ferramenta investigativa para pesquisas pré-clínicas.

Um método de transporte direcionado através do BBB com dano mínimo de tecido é o ultrassom focado transcranário (ME) juntamente com microbolhas para abrir o BBB11,12,13,14,15,16. A abertura do FUS BBB ganhou atenção recente para o tratamento de distúrbios neurodegenerativas, derrame e glioma, localizando terapêuticas para atingir regiões cerebrais como fatores neurotróficos17,18,19, terapias genéticas20,21,22, anticorpos23, neurotransmissores24, e nanopartículas25,26,27,28,29. Com sua ampla gama de aplicações e sua natureza não invasiva30,31, a abertura do FUS BBB é uma alternativa ideal para injeções intracranianas estereotaxas rotineiras. Além disso, devido ao seu uso atual em humanos30,32, investigações pré-clínicas usando essa técnica podem ser consideradas altamente translacionais. No entanto, a abertura do FUS BBB ainda não foi uma técnica amplamente estabelecida em ciência básica e pesquisa pré-científica devido à falta de acessibilidade. Por isso, fornecemos um protocolo detalhado para uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB como ponto de partida para laboratórios interessados em estabelecer essa técnica.

Estes estudos foram conduzidos com um transdutor de ultrassom específico de ar apoiado por ar de alta potência ou um transdutor de imersão ultrassônica de baixa potência. Os transdutores foram conduzidos por um amplificador de energia RF projetado para cargas reativas e um gerador de função de bancada padrão. Os detalhes para esses itens podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da UAB. 1. Configuração focada do equipamento de condução de ultrassom Utilize 50 cabos BNC coaxiais Ohm para conectar (1) a entrada do transdutor de ultrassom à saída do amplificador RF e (2) a entrada do amplificador RF à saída do gerador de função. Ajuste o modo gerador de função para uma rajada sinusoide uma vez por…

Representative Results

Aqui, demonstramos que o ultrassom focado com microbolhas pode induzir abertura de BBB localizada utilizando os parâmetros especificados acima com o transdutor de imersão de baixa potência(Figura 3) e o transdutor FUS(Figura 4). Primeiro, em experimentos iniciais, o transdutor de imersão de baixa potência foi direcionado para um hemisfério cerebral anterior(Figura 3b) ou medial(Figura 3a). Os anim…

Discussion

Aqui descrevemos uma abordagem benchtop para microbolhas assistida fus bbb abertura com abordagens alternativas, incluindo, dois transdutores diferentes e métodos para direcionamento intracraniano com e sem orientação de ressonância magnética. Atualmente, para estabelecer a abertura do FUS BBB guiado por RESSONÂNCIA Magnética no laboratório, há a opção de comprar excelentes dispositivos prontos para uso que fornecem resultados altamente padronizados e reprodutíveis com interfaces fáceis de usar. No entanto, …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada em parte por uma bolsa de Infraestrutura de Pesquisa da NSF EPSCoR para a Universidade Clemson (1632881). Além disso, esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Os autores reconhecem com gratidão o uso dos serviços e instalações da Universidade do Alabama em Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Os autores reconhecem Rajiv Chopra por seu apoio e orientação.

Materials

Bubble shaker Lantheus Medical Imaging VMIX VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles
Catheter plug/ Injection cap SAI infusion technologies Part Number: IC Catheter plug/ Injection cap
Evans blue dye Sigma E2129-10G Evans blue dye
Function generator Tektronix AFG3022B Dual channel, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHz FUS Instruments TX-110 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone
Heating pad for Mice and Rats Kent Scientific PS-03 Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats
Infusion pump KD Scientific 780100 KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tape Gizmo Dorks https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		 Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack
Low power immersion transducer, 1MHz Olympus V303-SU Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet sets WINOMO https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		 WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets
RF amplifier E&I A075 75W
Tail vein catheter BD 382512/ Fisher Item: NC1228513 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubbles Lantheus Medical Imaging DE4, DE16 DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gel Aquasonic https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		 Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga. Fisher Healthcare 22-258087 Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller software N/A N/A custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller software National Instruments LabView runtime engine version 2017 or better https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) Velmex
bolts Velmex MB-1 BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controller Velmex VXM-3 Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converter Velmex VXM-USB-RS232 USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1
x-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damper Velmex D6CL-6.3F D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motor Velmex PK266-03B-P2 Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointer https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic frame https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holder https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRI Bruker Bruker BioSpec 94/20 ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFP Addgene
Cream hair remover Church & Dwight Nair cream
gadobutrol MRI contrast agent Bayer Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frame Stoelting #51500 not MRI compatible
turnkey FUS delivery device FUS Instruments RK-300 ready to use MRI compatible FUS for rodents
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson’s disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -. Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson’s disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson’s disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -. H., Lin, C. -. Y., Liu, H. -. L., Yeh, C. -. K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -. H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
  31. Chen, K. -. T., Wei, K. -. C., Liu, H. -. L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
  33. . Compound Administration I Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020)
  34. Liu, H. -. L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O’Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).

Tags

Focused UltrasoundBlood-brain BarrierRat ModelMicro-bubblesMRIStereotaxic FrameBrain RegionAnesthesiaCatheterTail Vein

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image