שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית
Summary
כאן, מוצג פרוטוקול לחילוץ וקיטלוג אופטי של חתימות פלואורסצנטיות תאיות מולדות (כלומר, אוטופלואורסצנטיות תאית) מכל תא חי בודד המופץ במרחב תלת מימדי. שיטה זו מתאימה לחקר חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של מערכות ביולוגיות מגוונות ברזולוציה של תא אחד, כולל תאים מחיידקים, פטריות, שמרים, צמחים ובעלי חיים.
Abstract
מתואר כאן הוא השתקפות קונפוקלית בסיוע מיקרוסקופיה ניתוח פלואורסצנטיות מולדת (CRIF), שיטה זעיר פולשנית לשחזור חתימת הפלואורסצנטיות התאית המולדת מכל תא חי בודד באוכלוסייה המופצת במרחב תלת מימדי (תלת-ממדי). חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של תא היא אוסף של אותות פלואורסצנטיות הנפלטים על ידי ביומולקולים שונים בתוך התא. מחקרים קודמים קבעו כי חתימות פלואורסצנטיות מולדות משקפות תכונות תאיות שונות והבדלים במצב הפיזיולוגי ומהוות מקור מידע עשיר לאפיון וזיהוי תאים. חתימות פלואורסצנטיות מולדות נותחו באופן מסורתי ברמת האוכלוסייה, מה שמחייב תרבות כלונסאות, אך לא ברמת התא הבודד. CRIF מתאים במיוחד למחקרים הדורשים רזולוציה תלת-ממדית ו/או מיצוי סלקטיבי של אותות פלואורסצנטיות מתאים בודדים. מכיוון שחתימת הפלואורסצנטיות היא מאפיין מולד של תא, CRIF מתאים גם לחיזוי ללא תגים של סוג ו /או מצב פיזיולוגי של תאים שלמים ובודדים. שיטה זו עשויה להיות כלי רב עוצמה לניתוח תאים יעיל, שבו הפנוטיפ של כל תא בודד באוכלוסייה הטרוגנית יכול להיות מוערך ישירות על ידי חתימת autofluorescence שלה תחת מיקרוסקופ ללא תיוג תאים.
Introduction
ביומולקולים מגוונים בתוך תא 1 פולטים אותות פלואורסצנטיות אוטומטית, וחתימת הפלואורסצנטיות המולדת של תא מורכבת מהרכבה של אותות אלה. פלואורסצנטיות חתימה זו משקפת תכונות תאיות שונות וגם הבדלים במצב הפיזיולוגי. ניתוח של פלואורסצנטיות מולדת הוא זעיר פולשני ויכול להשלים בדיקות מיקרוביולוגיות מסורתיות ו פולשניות יותר שמשאירות מגוון של עקבות משינוי מטבולי קל להרס תאים מלא. בעוד טכניקות מסורתיות כגון DNA או חילוץ תוכן תא2,3, פלואורסצנטית בהכלאה במקום4, והכנסת גנים עיתונאי פלואורסצנטי לגנום יעילים בקביעת סוג התא או מצב פיזיולוגי, הם בדרך כלל דורשים מניפולציה של התאים או תיוג פולשני.
מחקרים על הפלואורסצנטיות המולדת של מושבות מיקרוביאליות חיות ושלמות שונות, כולל השעיות של תרבית מיקרואורגניאלית בתפזורת5,6, בוצה פעילה7, רקמות יונקים8,9 ותאי יונקים1,10, הראו כי ניתוח פלואורסצנטיות מולד מאפשר ניתוח ללא תגים של סוגי תאים ומצב פיזיולוגי. חתימות פלואורסצנטיות מולדות נותחו באופן מסורתי ברמת האוכלוסייה ולא ברמת התא הבודד, ולכן מחייבות תרבות כלונסאות. לעומת זאת, טכניקת ה-innate fluorescence של innate (CRIF) בסיוע מיקרוסקופיה confocal,11 המתוארת כאן משחזרת ומקטלגת את חתימת הפלואורסצנטיות התאית המולדת של כל תא מיקרוביאלי חי. יתר על כן, CRIF יכול לאסוף באופן שיטתי את חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של תא מיקרוביאלי יחיד בתוך אוכלוסייה המופצת במרחב תלת מימדי (תלת-ממדי).
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן שתי נקודות קריטיות בשיטה זו שיש לעקוב אחריהן מקרוב כדי להשיג תוצאות ניתנות לשחזור: 1) לשמור על תפוקת כוח הלייזר תחת מטרת המיקרוסקופ עקבית באמצעות אורכי גל עירור וניסויים, ו -2) לבצע פילוח תאים מדויק.
הנקודה הראשונה חשובה במיוחד כאשר משווים את חתימת הפלואורסצנטיות המולדת …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק סיוע למחקר מדעי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט והטכנולוגיה של יפן (18K04843) ל- Y. Yawata, ה- JST ERATO (JPMJER1502) ל- N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
Referências
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
