Reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires par microscopie confocale

Summary

Ici, un protocole est présenté pour extraire optiquement et cataloguer les signatures de fluorescence cellulaire innée (c’est-à-dire l’autofluorescence cellulaire) de chaque cellule vivante individuelle distribuée dans un espace tridimensionnel. Cette méthode convient à l’étude de la signature de fluorescence innée de divers systèmes biologiques à une résolution unicellulaire, y compris les cellules de bactéries, de champignons, de levures, de plantes et d’animaux.

Abstract

L’analyse de fluorescence innée unicellulaire (CRIF) assistée par microscopie confocale assistée par microscopie à réflexion confocale est décrite ici, une méthode mini-invasive pour reconstruire la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule vivante individuelle dans une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D). La signature de fluorescence innée d’une cellule est une collection de signaux de fluorescence émis par diverses biomolécules à l’intérieur de la cellule. Des études antérieures ont établi que les signatures de fluorescence innées reflètent diverses propriétés cellulaires et différences d’état physiologique et constituent une riche source d’information pour la caractérisation et l’identification cellulaires. Les signatures de fluorescence innées ont traditionnellement été analysées au niveau de la population, nécessitant une culture clonale, mais pas au niveau de la cellule unique. CriF est particulièrement adapté aux études qui nécessitent une résolution 3D et/ou une extraction sélective des signaux de fluorescence de cellules individuelles. Parce que la signature de fluorescence est une propriété innée d’une cellule, CRIF convient également à la prédiction sans étiquette du type et / ou de l’état physiologique des cellules intactes et uniques. Cette méthode peut être un outil puissant pour l’analyse cellulaire rationalisée, où le phénotype de chaque cellule dans une population hétérogène peut être directement évalué par sa signature d’autofluorescence sous un microscope sans marquage cellulaire.

Introduction

Diverses biomolécules au sein d’une ^cellule1 émettent des signaux d’autofluorescence, et la signature de fluorescence innée d’une cellule consiste en l’assemblage de ces signaux. Cette fluorescence caractéristique reflète diverses propriétés cellulaires ainsi que des différences d’état physiologique. L’analyse de la fluorescence innée est peu invasive et peut compléter les sondes microbiologiques traditionnelles plus invasives qui laissent une gamme de traces allant d’une légère modification métabolique à la destruction cellulaire complète. Bien que les techniques traditionnelles telles que l’extraction de l’ADN ou du contenu ^{cellulaire2,3}, l’hybridation fluorescente in ^situ4 et l’introduction de gènes rapporteurs fluorescents dans le génome soient efficaces pour déterminer le type de cellule ou l’état physiologique, elles nécessitent généralement une manipulation des cellules ou un marquage invasif.

Des études sur la fluorescence innée de diverses colonies microbiennes vivantes et intactes, y compris les suspensions de culture microbienne en ^vrac5,6, les boues ^actives7, les tissus de ^{mammifères8,9} et les cellules de ^{mammifères1,10}, ont montré que l’analyse de fluorescence innée facilite l’analyse sans étiquette des types de cellules et de l’état physiologique. Les signatures de fluorescence innées ont été traditionnellement analysées au niveau de la population et non au niveau de la cellule unique, et nécessitent donc une culture clonale. En revanche, la technique d’analyse de fluorescence inéscence unicellulaire assistée par microscopie unicellulaire assistée par réflection confocale11 décrite ici reconstruit et catalogue la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule microbienne vivante individuelle. De plus, criF peut systématiquement rassembler la signature de fluorescence innée d’une seule cellule microbienne au sein d’une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D).

Protocol

1. Préparation de l’échantillon Placez un joint en silicone de 1 mm d’épaisseur avec des puits sur une lame en verre. Placez une dalle d’agarose de 1 mm d’épaisseur à 0,8 % (p/v) dans le puits du joint en silicone. Diluer la densité cellulaire d’une culture cellulaire microbienne arbitraire à une densité optique de 600 nm (OD660) = 1,0. Placer une aliquote de 5 μL de suspension cellulaire sur la dalle d’agarose. Couvrir doucement avec un co…

Representative Results

La figure 1A montre la signature de fluorescence unicellulaire typique d’une cellule bactérienne présentée sous la forme d’un diagramme de spectre traditionnel (en haut) et d’une carte thermique (au milieu). La figure 1B montre le résultat d’une segmentation cellulaire 2D précise superposée à l’image CRM originale d’une population de bactéries du sol (Pseudomonas putida KT2440)12. Les signatures de fluorescenc…

Discussion

Il y a deux points critiques dans cette méthode qui doivent être suivis de près pour obtenir des résultats reproductibles: 1) maintenir la puissance de sortie laser sous l’objectif du microscope cohérente à travers les longueurs d’onde d’excitation et les expériences, et 2) effectuer une segmentation cellulaire précise.

Le premier point est particulièrement important lorsque l’on compare la signature de fluorescence innée entre différentes expériences. Évitez d’appliquer…

Materials

Agarose	Wako Chemicals	312-01193
Beam splitters	Carl Zeiss, Nikon		MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscope	Carl Zeiss, Nikon		Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slips	Matsunami Glass	C024601
Glass slides	Matsunami Glass	S011120
Half-reflection mirror	Carl Zeiss, Nikon		NT80/20
Laser power meter	Thorlabs		PM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB Broth	Nacalai tesque	20066-95	For bacteria culture
Image analysis software	The MathWorks		MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objective	Carl Zeiss, Nikon	440762-9904	e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope software	Carl Zeiss, Nikon		ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)	Wako Chemicals	166-23555
Programming language			Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasket	ThermoFisher Scientific	P24744
Workstation			A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium	Sigma-Aldrich	Y1500-250G	For yeast culture
YPD medium	Sigma-Aldrich	Y1375-250G