Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.
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Artigo de método
Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético
Neste artigo
Resumo
Resumo
Exossomos são pequenas vesículas extracelulares liberadas por praticamente todas as células e secretadas em todos os fluidos biológicos. Muitos métodos foram desenvolvidos para o isolamento dessas vesículas, incluindo ultracentrifugação, ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho. No entanto, nem todos são adequados para purificação e caracterização de exossomos em larga escala. Delinea-se aqui um protocolo para o estabelecimento de culturas de fibroblastos primários isolados de músculos esqueléticos adultos de camundongos, seguido de purificação e caracterização de exossomos dos meios de cultura dessas células. O método baseia-se no uso de etapas de centrifugação sequencial seguidas de gradientes de densidade de sacarose. A pureza das preparações exossômicas é então validada por análises de western blot usando uma bateria de marcadores canônicos (i.e., Alix, CD9 e CD81). O protocolo descreve como isolar e concentrar exossomos bioativos para microscopia eletrônica, espectrometria de massa e experimentos de captação para estudos funcionais. Ele pode ser facilmente ampliado para cima ou para baixo e adaptado para isolamento de exossomos de diferentes tipos de células, tecidos e fluidos biológicos.
Introdução
Exossomos são vesículas extracelulares heterogêneas que variam em tamanho de 30 a 150 nm. Estabelecem-se como peças-chave nos processos fisiológicos e patológicos, dada a sua distribuição ubíqua em tecidos e órgãos 1,2. Os exossomos carregam uma carga complexa de proteínas, lipídios, tipos de DNA e tipos de RNA, que variam de acordo com o tipo de células das quais são derivadas 1,2,3. Os exossomos são enriquecidos em proteínas que têm diferentes funções (ou seja, tetraspaninas, incluindo CD9 e CD63) são responsáveis p....
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Protocolo
Todos os procedimentos em camundongos foram realizados de acordo com protocolos animais aprovados pelo St. Jude Children's Research Hospital, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e diretrizes do National Institutes of Health.
1. Preparação de soluções e meios
- Preparar a solução de digestão misturando 15,4 mL de PBS com 2,5 mL de 20 mg/mL de colagenase P (concentração final de 5 mg/mL), 2 mL de dispase II de 11 U/mL (concentração final de 1,2 U/mL) e 100 μL de CaCl2 de 1,0 M (concentração final de 5 mM).
- Preparar 500 mL de meio de fibroblastos primários (DMEM completo) misturando 440 mL de DMEM com....
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Resultados
Este protocolo é adequado para a purificação de exossomos de grandes volumes de meio condicionado de forma custo-efetiva. O procedimento é altamente reprodutível e consistente. A Figura 1 mostra a imagem de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de exossomos purificados do meio de cultura de fibroblastos primários de camundongos. A Figura 2 mostra o padrão de expressão proteica dos marcadores exossômicos canônicos e a ausência de contaminantes citosólicos (.......
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Discussão
Um passo crítico para o sucesso do isolamento dos exossomos dos meios de cultura, conforme descrito neste protocolo, é o estabelecimento e a manutenção adequados de culturas primárias de fibroblastos de camundongos do músculo esquelético adulto. Essas culturas precisam ser mantidas em um baixo nível de oxigênio para garantir condições fisiológicas (o nível de O2 no músculo esquelético é de ~2,5%)15. Os fibroblastos primários mudam de características quando passados em cultura muitas vez.......
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Divulgações
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Alessandra d'Azzo é titular da Cadeira Joalheira para Crianças (JFC) em Genética e Terapia Gênica. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do NIH R01GM104981, RO1DK095169 e CA021764, a Fundação Assis de Memphis e as Instituições de Caridade Associadas Sírias Libanesas Americanas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pratos de 10 cm | Midwest Scientific, TPP | TP93100 | |
| pratos de 15 cm | Midwest Scientific | TP93150 | |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Thermo Fisher Scientific, Pierce | 23225 | |
| Albumina de soro bovino Fração V | Roche | 10735094001 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-100G | |
| Centrífuga 5430R com rotores FA-35-6-30/ FA-45-48-11 | Eppendorf | 022620659/5427754008 | |
| Sistema de imagem Chemidoc MP | BioRad | 12003154 | |
| Collagenase P | Sigma, Roche | 11 213 857 001 | 100 mg |
| cOmplete protease inibidor cocktail | Millipore/Sigma, Roche | 11697498001 | |
| Criterion Blotter com eletrodos de placa | BioRad | ||
| Criterion TGX gel de proteína sem coloração | BioRad | 5678034 | 10% 18 poços, midi-gel |
| Criterion célula de eletroforese vertical (midi) | BioRad | NC0165100 | |
| Dispase II | Sigma, Roche | 04 942 078 001 | protease neutra, grau II |
| Ditiotreitol | Sigma/Millipore, Roche | 10708984001 | |
| Dulbecco' s Modificação Eagles Medium | Corning | 15-013-CV | |
| Dulbecco' s Fosfato Tampolado Salino | Corning | 21-031-CV | |
| Etanol 200 prova | Pharmco por Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL tubos de centrífuga cônicos | Corning | 352070 | |
| Soro Bovino Fetal | Gibco | 10437-028 | |
| Fluostar Omega leitor de microplacas multimodo | BMG Labtech | ||
| GlutaMAX suplemento | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Ácido clorídrico | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Immobilon-P Membranas de transferência | Millipore | IPVH00010 | |
| Laemmli tampão de amostra (4x) | BioRad | 1610747 | |
| Solução de acetato de magnésio | Sigma | 63052-100ml | |
| Leite em pó desnatado | LabScientific | M-0842 | |
| O2/CO2 incubadora | Sanyo | MC0-18M | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | 10.000 U/ml |
| Tubos de microcentrífuga premium | Fisher Scientific, Midwest Scientific | AVSC1510 | 1,7 mL |
| Bisturis | descartáveis protegidosFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker | 372610 | |
| Tampão de corrida | BioRad | 1610732 | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S271-3 | |
| Stericup Sistema de filtragem a vácuo estéril de liberação rápida-GP | Millipore | S2GPU05RE | 500 mL |
| Filtro de células estéreis (70 mm) | Fisher Scientific, marca | Fisher22-363-548 | |
| Sacarose | Fisher Scientific, Fisher Chemical | S5-500 | |
| SuperSignal west Femto | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| Tubos de polipropileno de parede fina | Beckman Coulter | 326823 | |
| Tampão de transferência | BioRad | 16110734 | |
| Ácido tricloroacético | Sigma | 91228-100G | |
| Solução Tris base | BioRad | 1610719 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443-100mL | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 12604-013 | Sem vermelho de fenol |
| Tween-20 | BioRad | #1610781 | |
| Ultra-centrífuga Optima XPM | Beckman Coulter | A99842 | |
| Tubo ultra-claro (14x89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tubos ultra-claros (25x89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | |
| Banho-maria Isotemp 220 | Fisher Scientific | FS220 |
Referências
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
- Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H.
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Reimpressões e permissões
