Summary
I denne artikel beskrives en trinvis protokol til opsætning af en ex vivo-svinemodel af bakteriel keratitis. Pseudomonas aeruginosa bruges som en prototypisk organisme. Denne innovative model efterligner in vivo infektion som bakteriel spredning er afhængig af bakteriens evne til at beskadige hornhindevæv.
Abstract
Ved udvikling af nye antimikrobielle stoffer afhænger dyreforsøgenes succes af nøjagtig ekstrapolering af antimikrobiel effekt fra in vitro-test til dyreinfektioner in vivo. De eksisterende in vitro-test overvurderer typisk antimikrobiel effekt, da der ikke tages højde for tilstedeværelsen af værtsvæv som en diffusionsbarriere. For at overvinde denne flaskehals, har vi udviklet en ex vivo svin hornhinde model af bakteriel keratitis ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa som en prototypisk organisme. Denne artikel beskriver forberedelsen af svin hornhinden og protokollen for etablering af infektionen. Skræddersyede glasforme muliggør ligetil opsætning af hornhinden til infektionsundersøgelser. Modellen efterligner in vivo infektion som bakteriel spredning er afhængig af bakteriens evne til at beskadige hornhindevæv. Infektionssted verificeres som en stigning i antallet af kolonidannende enheder, der vurderes ved hjælp af levedygtige pladetal. Resultaterne viser, at infektion kan fastslås på en meget reproducerbar måde i ex vivo corneas ved hjælp af den her beskrevne metode. Modellen kan udvides i fremtiden for at efterligne keratitis forårsaget af andre mikroorganismer end P. aeruginosa. Det endelige mål med modellen er at undersøge effekten af antimikrobiel kemoterapi på udviklingen af bakteriel infektion i et scenario, der er mere repræsentativt for in vivo-infektioner. Dermed vil den model, der er beskrevet her, reducere brugen af dyr til test, forbedre succesraten i kliniske forsøg og i sidste ende muliggøre hurtig oversættelse af nye antimikrobielle stoffer til klinikken.
Introduction
Hornhindeinfektioner er vigtige årsager til blindhed og forekommer i epidemiske proportioner i lav- og mellemindkomstlande. Sygdommens ætiologi varierer fra region til region, men bakterier tegner sig for et stort flertal af disse tilfælde. Pseudomonas aeruginosa er et vigtigt patogen, der forårsager en hurtigt fremadskridende sygdom. I mange tilfælde er patienterne tilbage med stromal ardannelse, uregelmæssig anstiftelse, kræver transplantation eller i værste fald mister et øje1,2.
Bakteriel keratitis forårsaget af P. aeruginosa er en vanskelig øjeninfektion at behandle, især på grund af den stigende fremkomst af antimikrobielle resistente stammer af P. aeruginosa. Inden for det sidste årti er det blevet klart, at testning og udvikling af nye behandlinger for hornhindeinfektioner generelt og dem, der er forårsaget af Pseudomonas sp., i særdeleshed, er afgørende for at bekæmpe den nuværende tendens i antibiotikaresistens3.
Til test af effekten af nye behandlinger for hornhindeinfektioner er konventionelle in vitro mikrobiologiske metoder et dårligt surrogat på grund af forskellen i bakteriel fysiologi under laboratoriekultur og under infektioner in vivo samt på grund af manglen på værtsgrænsefladen4,5. In vivo-dyremodeller er imidlertid dyre, tidskrævende, kan kun levere et lille antal replikater og give anledning til bekymring for dyrevelfærden.
I denne artikel demonstrerer vi en enkel og reproducerbar organotypisk ex vivo porcine model af keratitis, der kan bruges til at teste forskellige behandlinger for akutte og kroniske infektioner. Vi har brugt P. aeruginosa til dette eksperiment, men modellen fungerer også godt sammen med andre bakterier og organismer som svampe og gær, der forårsager keratitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Albino laboratoriekaniner blev ofret i laboratoriet for andet planlagt eksperimentelt arbejde under hjemmekontor godkendte protokoller. Øjnene var ikke nødvendige for eksperimentel brug i disse undersøgelser, så de blev brugt til denne protokol.
1. Sterilisering
- KRITISK TRIN: Desinficer alle pincet og saks ved iblødsætning i 1 time i 5% (v/v) opløsning af Distel i destilleret vand, rengør med en børste, skyl med vand fra hanen og steriliser i en ovn ved 185 °C i mindst 2 timer.
- Alle andre glasvarer og reagenser steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter, eller reagenser fremstilles i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Der udføres følgende procedurer i et sikkerhedsskab i klasse II mikrobiologi.
2. Prøveindsamling
- Samling af svin øjne
- Store hvide landrace søer, et kors med en Hampshire vildsvin blev brugt. Dyrene blev bedøvet med en elektrisk strøm, og øjnene blev inducleeret 2 timer senere på slagteriet.
- KRITISK TRIN: Når det er belyst, overføres øjnene til laboratoriet i en steril fosfatbufferet saltvandsopløsning (PBS) for at forhindre dem i at tørre ud og behandle dem straks ved ankomsten.
- Samling af kanin øjne
- Punktafgift hornhinder og sende til laboratoriet i steril PBS.
3. Forberedelse af corneoscleral-knappen
- Brug sterile pincet til at holde vævet omkring øjeæblet og overføre det til en petriskål. Fjern bindehinden og muskelvævet omkring øjeæblet på en petriskål ved hjælp af skalpelblad nr. 15 og pincet.
- Løft forsigtigt øjeæblet, mens du holder synsnerven med pincet og overføre til en 0,5 L krukke fyldt med steril PBS.
- Når alle øjne er ryddet for omgivende væv, flytte dem ved hjælp af sterile pincet til en anden 0,5 L krukke fyldt med 3% (v / v) povidone jod i PBS og lad i 1 min.
- Overfør øjne til en anden 0,5 L krukke med steril PBS.
- Brug pincet til at holde øjet stadig på en petriskål og gøre et snit i nærheden af hornhinden med en skalpel klinge nr. 10A.
- KRITISK TRIN: Hold kanten af snittet og brug en saks til at fjerne hornhinden og efterlade ca. 3 mm sclera omkring hornhinden. Sørg for, at den skarpe ende af saksen ikke gennemborer iris eller choroidal væv og er i supra-choroidal rummet.
- Hold corneoscleral knappen med pincet og bruge et andet par spidse ende pincet til forsigtigt at adskille uveal væv.
- Løft corneoscleral knappen fra de resterende kloden og kort skylle det i 1,5% (v / v) povidone jod opløsning i PBS i en 12 godt plade.
- Placer corneoscleral knappen i en anden 12 godt plade fyldt med steril PBS.
- Efter forarbejdning af alle øjne (anbefales maksimalt 40 øjne i et parti), skal hver hornhindeknap placeres på en individuel petriskål (34 mm diameter) epitelside op og hældes i 3 mL dyrkningsmedium forvarmet til 37 °C.
BEMÆRK: Sammensætningen af kulturmediet er som følger: Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM): Skinke [1:1] suppleret med 5 μg∙mL-1 insulin og 10 ng∙mL-1 epidermal vækstfaktor (EGF), 10% (v/v) føtal kalveserum (FCS), 100 U∙mL-1 penicillin, 100 U∙mL-1 streptomycin og 2,5 μg∙mL-1 amphotericin B. Som et valgfrit trin kan mediet suppleres med 50 g∙L-1 dextran for at forhindre hævelse af den punkterede hornhinde under de yderligere inkubationstrin. - Inkuber ved 37 °C i en befugtet vævskulturinkubator.
4. Vedligeholdelse af corneoscleral knapper
- Efter 24 timer skal du bruge aseptisk teknik til at fjerne medier og erstatte med 3 mL frisk forvarmet kulturmedie indeholdende antibiotika. Hold corneoscleral knapper i medier med antibiotika i 48 timer for at desinficere hornhinder. Inkuber ved 37 °C i en befugtet vævskulturinkubator.
- KRITISK TRIN: Efter 48 timer fjernes mediet og skylles hornhinder med 2 mL PBS. Derefter holde corneoscleral knapper i antibiotika-fri medier i mindst to eller ideelt tre dage før eksperimentel infektion, for at fjerne resterende antibiotika fra vævet.
- Inkuber ved 37 °C i en befugtet vævskulturinkubator. Skift medie mindst en gang til inden for disse tre dage. Kassér hornhinder, hvis der opstår uklarhed i det antibiotikafrie medium.
5. Forberedelse af et inoculum
- Hæld 10 mL LB bouillon i en 50 mL konisk kolbe med en skumprop.
- En koloni af P. aeruginosa stamme PAO1 eller stamme PA14 overføres fra en frisk agarplade og inkuberes ved 37 °C i 3-4 timer, indtil bakterierne er i midten af logfasen.
- Overfør bakteriekulturen til et 50 mL rør og centrifuge ved 3.000 x g i 5 min. Fjern supernatanten og ophæng cellepillen igen i PBS.
- Gentag trin 5.3 to gange mere for at vaske cellerne. Ophæng cellepillen igen i PBS, og den optiske massefylde justeres ved 600 nm til ca. 0,6 ved hjælp af steril PBS som blindprøve.
6. Inficere majshinden
- Fjern medier fra petriskålen og skyl hornhinder to gange med 1 mL steril PBS.
- Klem forsigtigt pincet, mens du holder hornhinden i-mellem. Brug en 10A skalpel til at foretage fire snit – to lodrette, to vandrette - i den centrale del af hornhinden gennem epitellaget til den underliggende stroma.
- Placer en steril glasform i en 6-brønds plade med den brede del op og læg hornhinden midt i glasformen, epitelsiden nedad. Lav snittet lige i midten af den nederste del af glasformen.
- KRITISK TRIN: Hæld 1 mL på 1% (w/ v) lavt smeltepunkt agar opløst i DMEM for at fylde glasformen med hornhinden helt.
- Lad agaren indstille og derefter vende glasformen, så hornhindeepitelet vender opad.
- Pipette 15 μL af bakteriekulturen med OD600nm = 0,6 (for P. aeruginosa svarer dette til ca. 1 x 107 kolonidannende enheder (CFU) i 15 μL) direkte i et afskåret område og tilsæt derefter 85 μL PBS til toppen for at holde hornhindeepitelet fugtigt. Fortynd den resterende bakteriekultur og plade på agar for at tælle kolonidannende enheder til inoculumet.
- Tilsæt 1 mL DMEM uden antibiotika til bunden af hver brønd med glasformen. 6-brøndspladen inkuberes med de inficerede majsskelknapper i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2 i op til 24 timer.
- Opret uinficeret kontrol hornhinden sammen med hvert eksperiment. For at etablere uinficeret kontrol skal bakteriekulturens 15 μL udskiftes i trin 6.6 med steril PBS.
7. Homogenisering af hornhinden for at høste bakterierne
- Dmem-mediet kasseres fra bunden af 6-brøndspladen, og der tilsættes 1 mL steril PBS for at skylle bunden af brønden.
- Fjern PBS forsigtigt ved pipettering uden at røre den centrale del af hornhinden. Fjern glasringen med sterile pincet og læg den i 5% Distel.
- Skyl forsigtigt toppen af majshinden med 1 mL PBS to gange [valgfrit].
- Hold kanten af hornhinden med fine spids tang og løsrive den fra agar nedenunder.
- Overfør hornhinden til et 50 mL rør fyldt med iskold 1-2 mL PBS.
- Brug en fin spids homogenisator til at ren og skær toppen af den inficerede hornhinde. Vævet behøver ikke at være helt flydende. Homogenisatoren hjælper med at løsne bakterier fra hornhindeepitelet og det afskårne område.
- Vortex hornhinden i PBS i et par sekunder for at blande indholdet.
- 20 μL homogenatet til 180 μL PBS tilsættes, og der foretages serielle fortyndinger i en 96 brøndplade.
- Suspensionen fortyndes serielt til 10-4 og 10-5 fortynding og pipette 10 μL af det fortyndede homogenat med bakterier på en blod agarplade. Inkubat pladen i 8 timer og tælle antallet af CFU. Ved afprøvning af virkningen af antimikrobielle stoffer skal man eksperimentelt nå frem til en passende fortyndingsfaktor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udformningen af glasforme er en innovativ og original idé, hvis brug gjorde det muligt for os at oprette modellen på en konsistent måde med minimal / ingen problemer med forurening. Formene blev udarbejdet af en glasblæser ved University of Sheffield baseret på et design (Figur 1A). Den eksperimentelle opsætning opretholder hornhindens konvekse form og holder bakterier på toppen af epitelet, hvor infektion finder sted (Figur 1B).
Porcine hornhinder normalt svulme op efter få dage i medium. Dette er normalt, og vi fandt ud af, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem hornhinder med og uden tilsætning af dextran, som normalt tilsættes for at forhindre hævelse af hornhinden (Figur 1H). Hornhindene er typisk såret for at hjælpe bakterierne trænge ind i epitel. Selv om der ikke var nogen signifikant forskel i udviklingen af infektion mellem sårede (cut) og unwounded (uncut) hornhinder, bemærkede vi flere variationer mellem replikater i uslebne hornhinder (Figur 1C). Vask af hornhinder to gange med PBS fjerner overskydende bakterier, der ikke er knyttet til epitelet. Der var en betydelig forskel i CFU mellem vaskede og uvaskede svine corneas inficeret med P. aeruginosa PAO1 i 24 timer (Figur 1D). Der var ingen signifikant forskel i CFU-tællinger mellem svin og kanin corneas inficeret med PA14 og PAO1 (Figur 1E,1F). Resultaterne for begge modeller kunne reproduceres. Efter 24 timer udvikler hornhinden, der er inficeret med enten Pseudomonas-stamme, altid uigennemsigtighed, og snitområdet bliver mere synligt og åbent i forhold til den uinficerede hornhinde (figur 1G).
Figur 1: Ex vivo hornhinde inficeret med Pseudomonas aeruginosa. (A) Skematisk billede af en glasform, der anvendes til at opretholde formen af hornhinden og lette indførelsen af bakterier og behandlinger. Tykkelsen af glasformene er 1,5 mm og er den samme som tykkelsen af reagensglas lavet af borosilikatglas. (B) Skematisk billede af forsøgsopsætningen. (C) Undersøgelse af sårpåvirkningen på det endelige CFU-antal efter homogenisering. Uslebne (n = 16) og skåret (n = 28) hornhinder blev smittet med P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PA14 i 24 timer. Hornhindene blev vasket med 1 mL PBS før homogenisering. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. (D) Undersøgelse af virkningen af vask af hornhinder med 2 x 1 mL PBS (n = 6) og ikke vask (n = 6) på det endelige CFU-antal efter infektion med P. aeruginosa PAO1 i 24 timer. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. (E) Endelig cfu-tælling i svin corneas inficeret med P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PA14 i 24 timer (n = 10). Hornhinder blev vasket og skåret. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. (F) Endelig CFU-optælling i kanin corneas inficeret med P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PA14 i 24 timer (n = 6). Hornhinder blev vasket og skåret. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. (G)Billeder af ex vivo porcin corneas inficeret med P. aeruginosa PAO1 i 24 timer. Kontrollen blev såret, men ingen bakterier blev tilføjet. De inficerede hornhinder blev såret, og 107 CFU blev tilføjet til den afskårne side. Ingen CFU blev genvundet fra kontrol hornhinden. (H) Endelig CFU genvundet efter 24 timers infektion med P. aeruginosa PAO1 fra hornhinder behandlet med dextran (n = 2) og dem uden dextran (n = 9). Hornhinder blev vasket og skåret. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vigtigste drivkraft bag udviklingen af denne keratitis model ved hjælp af ex vivo svin hornhinden er at give forskere, der udvikler nye antimikrobielle stoffer med en repræsentativ in vitro model til mere præcist at bestemme antimikrobiel effekt på prækliniske stadier. Dette vil give forskere, der er involveret i udviklingen af nye antimikrobielle stoffer, større kontrol over lægemiddeldesign og -formulering på de prækliniske stadier, øge succesen ved kliniske forsøg, reducere brugen af dyr ved at muliggøre målrettede undersøgelser og resultere i hurtigere oversættelse af nye antimikrobielle stoffer til klinikken.
En række undersøgelser har undersøgt virkningen af infektioner på ex vivo corneas fra forskellige dyr som: kanin6, hund7,ged 8 og svin9,10,11. De fleste af disse undersøgelser fokuserer på måder at etablere6 og visualisere en infektion9 , men indtil videre har der kun været et par publikationer med fokus på test af lægemidler og nøjagtig kvantificering af bakterier6,7,8,12.
Den primære fordel ved vores model er tilgængeligheden af svin corneas som en del af fødekæden. Anvendelsen af ex vivo porcin corneas er derfor i overensstemmelse med princippet om 3R, som er at erstatte, forfine og reducere brugen af dyr til forskning, samtidig med at der tilvejebringes en repræsentativ model af værtsgrænsefladen. Vi har ikke observeret nogen problemer med forurening af hornhinde explants, hvis protokollen er nøje fulgt. Glasformene er meget nemme, hurtige og ligetil at bruge uden krav om specialiseret udstyr. Den smalle ring øverst gør tilsætning af en lille mængde af et testet lægemiddel (100 μL) eller bakterier bekvemt. Ringen af glasformen tillader PBS med bakterier eller en lægemiddelopløsning, der skal bevares i den centrale del af hornhinden og forhindrer bakterierne i at komme under hornhinden. Ringen er let at rengøre og sterilisere og tillader observation af de ændringer, der opstår på toppen af hornhinden under infektion. Stammer af fluorescerende mærkede bakterier kan bruges til at visualisere infektion eller kvantificere spredningen af infektion i vævet ved hjælp af fluorescerende konfokal mikroskopi. Hele hornhinder kan yderligere behandles for histologi eller elektronmikroskopi imaging.
De kritiske trin er markeret i protokollen. Der skal lægges ekstra vægt på disse trin, når protokollen udføres for at sikre en vellykket infektion. De mest kritiske trin i protokollen er at sikre, at hornhinderne behandles med tilstrækkelig antibiotika til at forhindre infektion under forberedelsen, og derefter at antibiotikaene er tilstrækkeligt elimineret før indførelsen af den infektiøse organisme, i dette tilfælde P. aeruginosa. Ved opstilling af eksperimenterne ved hjælp af denne protokol udviklede turbiditet i nogle tilfælde sig under inkubation i det antibiotikafrie medium. Denne uklarhed var tegn på vækst af mikroorganismer i det antibiotikafrie medium. Dette kan skyldes ufuldstændig behandling af hornhinden ved hjælp af antibiotika eller på grund af forurening under håndtering. Disse hornhinder blev ikke videreført til yderligere forsøg og blev kasseret. Udvikling af turbiditet ved inkubation af hornhinder i antibiotikafrit medium blev undgået ved at anvende hyppige steriliseringskørsler i inkubatoren ved hjælp af engangspipettespidser med et filter og være tilstrækkelig forsigtig, når de steriliserer de værktøjer, der bruges til at udskille hornhinden fra svinøjnene. Et andet kritisk skridt er, når hornhinder er placeret i glasset formen før infektion. Glasformen gør det muligt for en at opretholde hornhindens konvekse form. Hornhindens konveksitet er en udfordring for fastholdelsen af enten den infektiøse dosis eller det terapeutiske middel på hornhindens overflade. Derfor er det vigtigt at sikre tilstedeværelsen af tilstrækkelig forsegling mellem hornhinden og glasformen. Når der er tilstrækkelig forsegling mellem hornhinden og glasformen, skaber ringstrukturen over formen et reservoir for at bevare enten den infektiøse dosis eller det terapeutiske middel. En passende forsegling sikres ved helt at fylde den brede del af glasformen med DMEM agar op til randen.
Som det er tilfældet med enhver model, er der begrænsninger forbundet med ex vivo porcine hornhinden model beskrevet. Den model, der er beskrevet heri, efterligner ikke sammensætningen, flowet og genopfyldningen af tårefilmen på tværs af hornhinden. Den mekaniske virkning, der leveres ved at blinke, er heller ikke indarbejdet i modellen. Der er enighed i litteraturen om, at rive filmsammensætning og dynamik, og blinkende er vigtige forsvarsmekanismer, der fjerner fremmede partikler og mikroorganismer fra øjet13. Faktisk, modellen mangler også en immunrespons, der udløses under infektion in vivo. Det er sandsynligt, at udviklingen af infektion in vivo i nærværelse af disse forsvarsmekanismer er anderledes end den, der er observeret i ex vivo-modellen beskrevet her. På trods af disse begrænsninger er ex vivo porcine corneal-modellen relevant for at teste effektiviteten af eksisterende og nye antimikrobielle stoffer af to hovedårsager: 1) bakteriernes fysiologi i ex vivo-modellen efterligner in vivo-betingelserne, da bakteriespredning er afhængig af deres evne til at beskadige hornhindevævet, og 2) modellen inkorporerer det tredimensionale væv som en dfusionsbarriere for terapier meget gerne i in vivo-situationen. Ex vivo-modellen er derfor fordelagtig i forhold til konventionelle teknikker til antimikrobiel følsomhedstest.
Ex vivo svin hornhinden model beskrevet her kan også bruges til at studere forskellige stammer af bakterier, svampe og gær, der forårsager keratitis. Denne ex vivo hornhinde model er reproducerbar og gør det muligt at generere replikater inden for kort tid i modsætning til in vivo modeller. I stedet for PBS, kunstige tårer eller vært immunforsvar celler kan teoretisk tilføjes for at efterligne den levende scenario. Hornhinder opnås fra samme race af grise og ca. 21-23 uger gamle, når de slagtes. Derfor er der mindre variation mellem replikater sammenlignet med dem, der opnås fra menneskelige kadavere. Begrebet brug af en svin ex vivo hornhinde model for biomedicinske anvendelser har fået mere popularitet inden for de sidste par år på grund af sin biologiske lighed med det menneskelige øje, som gør denne model lettere at sammenligne14. Der er øget interesse for at anvende porcin corneas til transplantation15,16 eller som model for tørre øjne17 eller sårheling18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Elliot Abattoir i Chesterfield for at give svin øjne. Glasringene er lavet på baggrund af vores design af glasblæseren Dan Jackson fra Institut for Kemi ved University of Sheffield. Forfatterne vil gerne takke Medical Research Council (MR/S004688/1) for finansieringen. Forfatterne vil også gerne takke fru Shanali Dikwella for teknisk hjælp med forberedelse af hornhinden. Forfatterne vil gerne takke Jonathan Emery for hjælp til formatering af billeder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S.
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C.
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
