माउस भ्रूण स्टेम सेल इन विट्रो से न्यूरोनल भेदभाव
Summary
यहां, हमने एक कम लागत और काम करने में आसान विधि की स्थापना की जो भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से न्यूरॉन्स में तेजी से और कुशल भेदभाव का निर्देश देती है। यह विधि प्रयोगशालाओं के बीच लोकप्रियकरण के लिए उपयुक्त है और न्यूरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
Abstract
माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (mESCs) का तंत्रिका भेदभाव न्यूरोजेनेसिस में शामिल प्रमुख तंत्र को स्पष्ट करने और पुनर्योजी दवा में संभावित सहायता के लिए एक संभावित उपकरण है। यहां, हमने संयोजन स्क्रीनिंग की रणनीतिका उपयोग करके, विट्रो में एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक कुशल और कम लागत विधि स्थापित की। यहां परिभाषित शर्तों के तहत, 2 दिवसीय भ्रूण शरीर गठन + 6 दिन रेटिनोइक एसिड प्रेरण प्रोटोकॉल एमसीसी से तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में तेजी से और कुशल भेदभाव की अनुमति देता है, जैसा कि अच्छी तरह से खड़ी और न्यूराइट-जैसे A2lox और १२९ डेरिवेटिव के गठन से देखा जाता है जो नेस्टिन पॉजिटिव हैं । भ्रूणीय शरीर की स्वस्थ स्थिति और उस समय बिंदु जिस पर रेटिनोइक एसिड (आरए) लागू किया जाता है, साथ ही आरए सांद्रता, इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण हैं। एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव में, N2B27 मध्यम II (न्यूरोबेसल माध्यम द्वारा पूरक) न्यूरोनल कोशिकाओं के दीर्घकालिक रखरखाव और परिपक्वता का बेहतर समर्थन कर सकता है। प्रस्तुत विधि अत्यधिक दक्षता, कम लागत और काम करने में आसान है, और न्यूरोबायोलॉजी और विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है।
Introduction
भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएसएसी) बहुलक हैं और तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में अंतर कर सकते हैं और बाद में कुछ शर्तों के तहत न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं1। ईएससी-आधारित न्यूरोजेनेसिस न्यूरोजेनेसिस की नकल करने के लिए सबसे अच्छा मंच प्रदान करता है, इस प्रकार विकासात्मक जीव विज्ञान अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा रत है और पुनर्योजी दवा2,3में संभावित सहायता करता है। पिछले दशकों में, भ्रूणीय न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए कई रणनीतियों की सूचना दी गई है, जैसे ट्रांसजेनिक विधि4,छोटे अणुओं का उपयोग करके5, 3डी मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरमेंट6का उपयोग करके, और सह-संस्कृति तकनीक7। हालांकि, इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल या तो सीमित स्थिति हैं या काम करना मुश्किल है, इस प्रकार वे अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
एमईसी से कुशल तंत्रिका भेदभाव प्राप्त करने के लिए एक आसान और कम लागत विधि खोजने के लिए, यहां एक संयोजन स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्रा 1में वर्णित है, भ्रूण न्यूरोजेनेसिस की पूरी प्रक्रिया को 2 चरणों में विभाजित किया गया था। चरण 1 एमसी से एनपीसी में भेदभाव प्रक्रिया को संदर्भित करता है, और द्वितीय चरण एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव से संबंधित है । आसान ऑपरेशन, कम लागत, आसानी से उपलब्ध सामग्री और उच्च भेदभाव दक्षता के सिद्धांतों के आधार पर, चरण 1 में सात प्रोटोकॉल और द्वितीय चरण में तीन प्रोटोकॉल पारंपरिक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली या भ्रूण शरीर निर्माण प्रणाली8,9के आधार पर चुने गए थे। दोनों चरणों में प्रोटोकॉल की भेदभाव दक्षता सेल आकृति अवलोकन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक चरण के सबसे कुशल प्रोटोकॉल के संयोजन के माध्यम से, हमने एमएससी से तंत्रिका भेदभाव के लिए अनुकूलित विधि स्थापित की।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन में, हमने कम लागत और आसानी से प्राप्त सामग्रियों के साथ, एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक सरल और प्रभावी विधि स्थापित की। इस विधि में, आरए प्रेरण के 6 दिनों के बाद भ्रूण शरीर के गठन के 2 द?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर ३१५०१०९९) और हुबेई प्रांत के शिक्षा विभाग के अधेड़ उम्र और युवा (नहीं) ने सपोर्ट किया । Q20191104) । और, हम माउस भ्रूणस्टेम सेल लाइनों A2lox प्रदान करने के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी के वुहान विश्वविद्यालय में प्रोफेसर वेनशेंग देंग का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson’s disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
