यहां, हमने एक कम लागत और काम करने में आसान विधि की स्थापना की जो भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से न्यूरॉन्स में तेजी से और कुशल भेदभाव का निर्देश देती है। यह विधि प्रयोगशालाओं के बीच लोकप्रियकरण के लिए उपयुक्त है और न्यूरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (mESCs) का तंत्रिका भेदभाव न्यूरोजेनेसिस में शामिल प्रमुख तंत्र को स्पष्ट करने और पुनर्योजी दवा में संभावित सहायता के लिए एक संभावित उपकरण है। यहां, हमने संयोजन स्क्रीनिंग की रणनीतिका उपयोग करके, विट्रो में एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक कुशल और कम लागत विधि स्थापित की। यहां परिभाषित शर्तों के तहत, 2 दिवसीय भ्रूण शरीर गठन + 6 दिन रेटिनोइक एसिड प्रेरण प्रोटोकॉल एमसीसी से तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में तेजी से और कुशल भेदभाव की अनुमति देता है, जैसा कि अच्छी तरह से खड़ी और न्यूराइट-जैसे A2lox और १२९ डेरिवेटिव के गठन से देखा जाता है जो नेस्टिन पॉजिटिव हैं । भ्रूणीय शरीर की स्वस्थ स्थिति और उस समय बिंदु जिस पर रेटिनोइक एसिड (आरए) लागू किया जाता है, साथ ही आरए सांद्रता, इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण हैं। एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव में, N2B27 मध्यम II (न्यूरोबेसल माध्यम द्वारा पूरक) न्यूरोनल कोशिकाओं के दीर्घकालिक रखरखाव और परिपक्वता का बेहतर समर्थन कर सकता है। प्रस्तुत विधि अत्यधिक दक्षता, कम लागत और काम करने में आसान है, और न्यूरोबायोलॉजी और विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है।
भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएसएसी) बहुलक हैं और तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में अंतर कर सकते हैं और बाद में कुछ शर्तों के तहत न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं1। ईएससी-आधारित न्यूरोजेनेसिस न्यूरोजेनेसिस की नकल करने के लिए सबसे अच्छा मंच प्रदान करता है, इस प्रकार विकासात्मक जीव विज्ञान अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा रत है और पुनर्योजी दवा2,3में संभावित सहायता करता है। पिछले दशकों में, भ्रूणीय न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए कई रणनीतियों की सूचना दी गई है, जैसे ट्रांसजेनिक विधि4,छोटे अणुओं का उपयोग करके5, 3डी मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरमेंट6का उपयोग करके, और सह-संस्कृति तकनीक7। हालांकि, इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल या तो सीमित स्थिति हैं या काम करना मुश्किल है, इस प्रकार वे अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
एमईसी से कुशल तंत्रिका भेदभाव प्राप्त करने के लिए एक आसान और कम लागत विधि खोजने के लिए, यहां एक संयोजन स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्रा 1में वर्णित है, भ्रूण न्यूरोजेनेसिस की पूरी प्रक्रिया को 2 चरणों में विभाजित किया गया था। चरण 1 एमसी से एनपीसी में भेदभाव प्रक्रिया को संदर्भित करता है, और द्वितीय चरण एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव से संबंधित है । आसान ऑपरेशन, कम लागत, आसानी से उपलब्ध सामग्री और उच्च भेदभाव दक्षता के सिद्धांतों के आधार पर, चरण 1 में सात प्रोटोकॉल और द्वितीय चरण में तीन प्रोटोकॉल पारंपरिक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली या भ्रूण शरीर निर्माण प्रणाली8,9के आधार पर चुने गए थे। दोनों चरणों में प्रोटोकॉल की भेदभाव दक्षता सेल आकृति अवलोकन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक चरण के सबसे कुशल प्रोटोकॉल के संयोजन के माध्यम से, हमने एमएससी से तंत्रिका भेदभाव के लिए अनुकूलित विधि स्थापित की।
वर्तमान अध्ययन में, हमने कम लागत और आसानी से प्राप्त सामग्रियों के साथ, एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक सरल और प्रभावी विधि स्थापित की। इस विधि में, आरए प्रेरण के 6 दिनों के बाद भ्रूण शरीर के गठन के 2 द?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर ३१५०१०९९) और हुबेई प्रांत के शिक्षा विभाग के अधेड़ उम्र और युवा (नहीं) ने सपोर्ट किया । Q20191104) । और, हम माउस भ्रूणस्टेम सेल लाइनों A2lox प्रदान करने के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी के वुहान विश्वविद्यालय में प्रोफेसर वेनशेंग देंग का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
Coverslips | NEST | 801007 | |
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
6 – well plate | Corning | 3516 | |
60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |