الهدف من البروتوكول هو مقارنة ظروف طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) المختلفة لتقييم كيفية تأثير الطلاء التفاضلي على معدل نمو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). على وجه الخصوص ، نهدف إلى تهيئة الظروف للحصول على النمو الأمثل لثقافات iPSC.
تركز هذه الدراسة على فهم كيف يمكن أن تؤثر زراعة iPSCs على ركائز طلاء ECM المختلفة على التقاء الخلايا. تم إنشاء بروتوكول لتقييم التقاء iPSC في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى عد الخلايا في تعليق خلية واحدة لتجنب أي اضطراب في النمو. تم استخدام نظام تحليل الصور عالي المحتوى لتقييم التقاء iPCS على 4 ECMs مختلفة بمرور الوقت بطريقة آلية. تم استخدام إعدادات تحليل مختلفة لتقييم التقاء الخلايا من iPSCs الملتصقة ولم يلاحظ سوى اختلاف طفيف (في 24 و 48 ساعة مع laminin) سواء تم تطبيق قناع 60 أو 80 أو 100٪. نظهر أيضا أن laminin يؤدي إلى أفضل التقاء مقارنة ب Matrigel و vitronectin و fibronectin.
يتم الحصول على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من الخلايا الجسدية ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا. غالبا ما يتم استخدامها كنظام لنمذجة التسبب في المرض أو إجراء فحص المخدرات ، كما أنها توفر إمكانية استخدامها في سياق الطب الشخصي. نظرا لأن iPSCs لديها إمكانات كبيرة ، فمن المهم توصيفها بالكامل لاستخدامها كنظام نموذجي موثوق. لقد أظهرنا سابقا أهمية زراعة iPSCs في بيئة نقص الأكسجين حيث تعتمد هذه الخلايا على تحلل السكر ويمكن أن تتسبب البيئة الهوائية في اختلال الأكسدةوالاختزال 1. كما أن iPSCs معرضة أيضا لظروف الاستزراع الأخرى ، لا سيما البيئة خارج الخلية. يعد تحسين ظروف الاستزراع قضية رئيسية للحفاظ على صحتهم وتكاثرهم. ستؤدي ثقافة iPSC الصحية إلى خلايا متمايزة صحية تكون عموما نقطة النهاية للنموذج المستخدم لفهم السمات الجزيئية والخلوية والوظيفية لاضطرابات بشرية أو عمليات خلوية محددة.
في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتوكول بسيط لاختبار التقاء iPSCs باستخدام ظروف طلاء مختلفة في آبار منفصلة. تتطلب iPSCs طبقة مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEF) من أجل الالتصاق بشكل صحيح ، لكن التعايش بين iPSCs و MEF يجعل من الصعب إجراء تحليل مثل الحمض النووي الريبي أو استخراج البروتين نظرا لوجود مجموعتين من الخلايا. من أجل تجنب طبقة التغذية ، تم استخدام بروتينات مختلفة تنتمي إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) لإعادة إنشاء مكانة الخلية الطبيعية والحصول على ثقافة iPSC خالية من التغذية. على وجه الخصوص ، Matrigel عبارة عن مستحضر غشاء قاعدي قابل للذوبان مستخرج من ساركوما الماوس Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، والتي يتم تخصيبها في بروتينات مصفوفة خارج الخلية (أي laminin ، الكولاجين IV ، بروتيوغليكان كبريتات الهيباران ، entactin / nidogen ، وعوامل النمو)2,3. شروط الطلاء الأخرى المستخدمة هي بدلا من ذلك البروتينات المنقاة ذات الصلة المعروفة في بناء ECMs: من المعروف أن laminin-521 تفرزه الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في كتلة الخلايا الداخلية للجنين وهي واحدة من أكثر اللامينين شيوعا في الجسم بعد الولادة4،5،6،7،8،9 ، 10,11; vitronectin عبارة عن مصفوفة زراعة خلايا خالية من xeno معروفة بدعم نمو وتمايز hPSC12،13،14،15،16 ؛ الفبرونيكتين هو بروتين ECM مهم لتطور الفقاريات وربط وصيانة الخلايا الجذعية الجنينية في حالة متعددة القدرات17،18،19،20،21،22،23،24،25. نظرا لتوفر ظروف طلاء مختلفة ، فإننا نقارنها من حيث تأثيرها على التقاء iPSCs.
إن استخدام iPSCs لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية في المستقبل جنبا إلى جنب مع تطبيقها المحتمل في الطب الدقيق يجعلها تقنية ذات أهمية كبيرة ولهذا السبب نعتقد أنه من الضروري أن نفهم بوضوح حالة الزراعة في المختبر التي تشبه بشكل أفضل الحالة الفسيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا السياق ، اختبر?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم الدراسة بمنح من مؤسسة بامبينو جيسو و Ricerca Corrente (وزارة الصحة الإيطالية) إلى C.C. نود أن نشكر الدكتور إنريكو بيرتيني (قسم علم الأعصاب ، وحدة الأمراض العصبية العضلية والتنكسية العصبية ، مختبر الطب الجزيئي ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، الدكتورة ستيفانيا بيتريني (المرفق الأساسي للفحص المجهري البؤري ، مختبرات الأبحاث ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، جوليا بيريكولي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) وروبرتا فيريتي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) للمناقشات العلمية والمساعدة الفنية. حصلت ماريا فينشي على “زمالة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة”.
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
H2O | MILLIQ | ||
Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |