Целью протокола является сравнение различных условий покрытия внеклеточного матрикса (ECM) для оценки того, как дифференциальное покрытие влияет на скорость роста индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). В частности, мы стремимся создать условия для получения оптимального роста культур iPSC.
Это исследование фокусируется на понимании того, как выращивание IPSC на различных подложках покрытия ECM может повлиять на слияние клеток. Протокол для оценки слияния iPSC в режиме реального времени был создан без необходимости подсчета клеток в одноклеточной суспензии, чтобы избежать любого возмущения роста. Система анализа изображений с высоким содержанием использовалась для автоматизированной оценки слияния iPCS на 4 различных ECM с течением времени. Для оценки слияния клеток адгезивных ИПСК использовались различные параметры анализа, и наблюдалась лишь небольшая разница (через 24 и 48 часов с ламинином), независимо от того, применялась ли маска 60, 80 или 100%. Мы также показываем, что ламинин приводит к лучшему слиянию по сравнению с Матригелем, витронектином и фибронектином.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получают из соматических клеток и могут быть дифференцированы в различные типы клеток. Они часто используются в качестве системы для моделирования патогенеза заболеваний или проведения скрининга лекарств, а также предлагают потенциал для использования в контексте персонализированной медицины. Поскольку iPSC обладают большим потенциалом, важно полностью охарактеризовать их для использования в качестве надежной модельной системы. Ранее мы показали важность выращивания иПСК в гипоксической среде, поскольку эти клетки полагаются на гликолиз, а аэробная среда может вызвать окислительно-восстановительный дисбаланс1. ИПСК также уязвимы к другим условиям культивирования, особенно к внеклеточной среде. Оптимизация условий культуры является ключевым вопросом для поддержания их здоровья и распространения. Здоровая культура iPSC приведет к здоровым дифференцированным клеткам, которые обычно являются конечной точкой модели, используемой для понимания молекулярных, клеточных и функциональных особенностей конкретных расстройств человека или клеточных процессов.
В этом исследовании был использован простой протокол для проверки слияния иПСК с использованием различных условий покрытия в отдельных скважинах. IPSCs требуют питательного слоя мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) для правильного присоединения, но сосуществование iPSCs и MEF затрудняет выполнение анализа, такого как РНК или экстракция белка, поскольку присутствуют две популяции клеток. Чтобы избежать фидерного слоя, различные белки, принадлежащие к внеклеточному матриксу (ECM), были использованы для воссоздания естественной клеточной ниши и создания культуры iPSC без фидера. В частности, Матригель представляет собой солюбилизированный препарат базальной мембраны, извлеченный из саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (EHS), который обогащен белками внеклеточного матрикса (т.е. ламинином, коллагеном IV, протеогликанами сульфата гепарана, энтактином/нидогеном и факторами роста)2,3. Другими используемыми условиями покрытия вместо этого являются очищенные белки, имеющие известное значение при построении ECM: ламинин-521, как известно, секретируется человеческими плюрипотентными стволовыми клетками (hPSCs) во внутренней клеточной массе эмбриона, и это один из наиболее распространенных ламининов в организме после рождения 4,5,6,7,8,9, 10,11; витронектин представляет собой матрицу клеточной культуры без ксено, которая, как известно, поддерживает рост и дифференцировку hPSC 12,13,14,15,16; фибронектин является белком ECM, важным для развития позвоночных и прикрепления и поддержания эмбриональных стволовых клеток в плюрипотентном состоянии 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Поскольку доступны различные условия покрытия, мы сравниваем их с точки зрения их влияния на слияние иПСК.
Использование ИПСК для моделирования заболеваний и будущего скрининга лекарств вместе с их возможным применением в прецизионной медицине делает ее технологией большой актуальности, и по этой причине мы считаем, что необходимо четко понимать условия культивирования in vitro, которые луч?…
The authors have nothing to disclose.
Исследование было поддержано грантами Фонда Бамбино Джезу и Ricerca Corrente (Министерство здравоохранения Италии) C.C. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Энрико Бертини (Отделение неврологии, Отделение нервно-мышечных и нейродегенеративных заболеваний, Лаборатория молекулярной медицины, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу), д-ра Стефанию Петрини (Конфокальная микроскопическая основная установка, Исследовательские лаборатории, Детская исследовательская больница Bambino Gesù), Джулию Периколи (Отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Bambino Gesù) и Роберта Ферретти (отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу) для научных дискуссий и технической помощи. Мария Винчи является получателем стипендии «Дети с раком в Великобритании».
10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
H2O | MILLIQ | ||
Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |