Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)
Summary
Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.
Abstract
Le zanzare rappresentano un problema significativo di salute pubblica come vettori di vari agenti patogeni. Per quegli studi che richiedono una valutazione dei parametri di fitness delle zanzare, in particolare la produzione di uova e i tassi di schiusa a livello individuale, i metodi convenzionali hanno gravato in modo sostanziale sugli investigatori a causa dell’elevata intensità di lavoro e dei requisiti di spazio di laboratorio. Descritto è un metodo semplice che utilizza 24 piastre di coltura tissutale del pozzo con agarosio in ogni pozzo e imaging digitale di ogni pozzo per determinare il numero di uova e i tassi di schiusa a livello individuale con requisiti di tempo e spazio sostanzialmente ridotti.
Introduction
Il controllo delle zanzare per proteggere gli esseri umani da agenti patogeni trasmesse da vettori è un importante obiettivo di salute pubblica, principalmente a causa della mancanza di vaccini efficaci per la maggior parte degli agenti patogeni trasportati dalle zanzare. Molti studi mirano a ridurre la forma fisica delle zanzare in combinazione con una strategia di riduzione della popolazioneapplicabile sul campo 1,2,3. Ciò include studi approfonditi per creare zanzare transgeniche e / o linee knockout CRISPR / Cas9. Tali approcci di modifica della popolazione richiedono una valutazione dettagliata dei singoli parametri di idoneità4. Le tecniche di laboratorio convenzionali per valutare l’idoneità delle zanzare femminili includono il contenimento individuale di zanzare femminili accoppiate e alimentate a sangue in contenitori da 100 ml5,tubi conici modificati da 50 ml o tubi per l’allevamento di Drosophila modificati fornendo superfici umide utilizzando cotone umido e dischi di carta filtrante per l’ovideposizione (cioè carte d’uovo)1,2,6,7. Tali metodi richiedono uno spazio relativamente grande (ad esempio, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H per un massimo di 100 tubi Drosophila) (Figura 1),e la manipolazione di singole carte uovo per il conteggio di uova e larve da cova, che possono essere laboriose. Questo manoscritto presenta un metodo per contare le uova di zanzara e determinare i tassi di schiusa utilizzando 24 piastre di pozzo e agarosio come superficie di ovideposizione peraggirare questi problemi 8.
Contemporaneamente, Ioshino etal. Il loro protocollo rappresentava un miglioramento significativo rispetto ai metodi convenzionali nel risparmiare tempo espazio 9. Tuttavia, il protocollo che hanno descritto continua a utilizzare carta filtrante bagnata come superficie per l’ovideposizione, che richiede lo spiegamento di ogni singola carta per ottenere conteggi, poiché le uova si trovano spesso sotto o in pieghe. Il loro protocollo inoltre non includeva l’uso di tecnologie di imaging o un metodo per il conteggio larvale.
Presentato è un metodo migliorato per eseguire test di fitness per il numero di uova (cioè fecondità) e il tasso di schiusa (cioè la fertilità) usando l’agarosio come superficie di ovideposizione in un formato di piastra di coltura tissutale di 24 po ‘per Ae. aegypti che oviposit su superfici umidi. Queste tavole sono state chiamate piatti “EAgaL”, da Egg, Agarose e Larva. Questi 24 piastre di pozzo forniscono alle singole zanzare una superficie minima per deporre le uova, semplificando e riducendo drasticamente il tempo e lo sforzo necessari per contare e mantenere le uova e le larve tratteggiate per alcuni giorni. La piastra EAgaL utilizza agarosio traslucido per la superficie di ovideposizione, che elimina la necessità di maneggiare le carte uovo e trovare le uova e le larve quando schiuse; fotografare ogni pozzo stabilisce una registrazione archiviata a lungo termine dei risultati e separa il processo di conteggio sia nel tempo che nello spazio dal processo di allevamento / movimentazione, dove il tempo è spesso limitato.
Protocol
Representative Results
Discussion
La piastra EAgaL riduce drasticamente il lavoro, il tempo e lo spazio per condurre test individuali di fecondità e fertilità in Aedes aegypti rispetto al metodo FT. Il confronto preliminare tra il metodo FT e la piastra EAgaL ha comportato tempi più brevi per tutte le fasi (la tecnica di imaging è stata applicata al metodo FT)(tabella 1). Come riferimento, nella tabella 2 sono fornite una stima dei costi di avviamento e di dosaggio (una piastra EAgaL da 24 pozzi contro 24 TT…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program per il finanziamento. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Adelman per l’aiuto nello sviluppo di questo metodo e suggerimenti durante la stesura del manoscritto, così come i membri del laboratorio Kevin Myles. Ringraziamo anche i recensori e gli editori per il loro aiuto nel migliorare questo manoscritto.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
Referências
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