एक विषमता कोशिका प्रणाली में प्रोटीन एकत्रीकरण के माध्यम से ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन को मापने
Summary
यहां, हम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक विषमता कोशिका प्रणाली में ट्रांस में लिगांड-रिसेप्टर इंटरैक्शन को तेजी से और अर्धकंठितकरने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
सेलुलर इंटरफेस पर प्रोटीन इंटरैक्शन ऊतक विकास और कैंसर प्रगति से लेकर इसके गठन और रखरखाव तक जैविक परिणामों की एक भीड़ तय करते हैं। इनमें से कई मौलिक बातचीत ट्रांस में होती है और आम तौर पर झिल्ली लंगरबद्ध बाध्यकारी जोड़े को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के बीच हेट्रोफिलिक या होमोफिलिक इंटरैक्शन से प्रेरित होती है। कैसे रोग प्रासंगिक उत्परिवर्तन इन मौलिक प्रोटीन बातचीत को बाधित स्पष्ट सेल जीव विज्ञान क्षेत्रों के असंख्य में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परखें आमतौर पर सीआईएस और ट्रांस इंटरैक्शन के बीच अस्पष्ट नहीं होती हैं, जो संभावित रूप से वीवो में होने वाली बाध्यकारी की सीमा का अधिक अनुमान लगाते हैं और इसमें प्रोटीन और/या विशेष निगरानी उपकरणों की श्रम गहन शुद्धि शामिल होती है । यहां, हम एक अनुकूलित सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो लंबे प्रोटीन शुद्धिकरण या विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना केवल ट्रांस इंटरैक्शन के अवलोकन और मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। एचईके सेल एकत्रीकरण परख में एचईके कोशिकाओं की दो स्वतंत्र आबादी का मिश्रण शामिल है, प्रत्येक झिल्ली-बाध्य कॉग्नेट लिगांड व्यक्त करता है। एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि के बाद, नमूनों को चित्रित किया जाता है और परिणामस्वरूप एकत्रित होते हैं।
Introduction
सिनैप्टिक आसंजन अणुओं द्वारा सुविधाजनक सिनैप्टिक इंटरैक्शन विकास, संगठन, विनिर्देश, रखरखाव और सिनैप्स के कार्य और तंत्रिका नेटवर्क की पीढ़ी के लिए मूलभूत हैं। इन ट्रांससिनैप्टिक कोशिका आसंजन अणुओं की पहचान तेजी से बढ़ रही है; इस प्रकार, बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करना और यह समझना मौलिक रूप से महत्वपूर्ण है कि ये नए आसंजन अणु एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम अनुक्रमण ने इनमें से कई आसंजन अणुओं में उत्परिवर्तनों की पहचान की है जो आमतौर पर न्यूरोडेवलपमेंटल, न्यूरोसाइकियाट्रिक और व्यसन विकारों की एक भीड़ से जुड़े होते हैं1। जीन में उत्परिवर्तन जो सिनैप्टिक सेल-आसंजन अणुओं के लिए कोड हानिकारक रूप से ट्रांस इंटरैक्शन को बदल सकता है और सिनैप्स गठन और या रखरखाव में रोगविज्ञानी परिवर्तन में योगदान दे सकता है।
मात्रात्मक रूप से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन जैसे आइसोथर्मल कैलोरिमेट्री, परिपत्र डिक्रोमिज्म, सतह प्लाज्मन अनुनाद2 और हालांकि मात्रात्मक प्रकृति में, उनकी कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, उन्हें फिर से संयोजन प्रोटीन की आवश्यकता होती है, कभी-कभी लंबे और थकाऊ शुद्धिकरण चरणों की मांग करते हैं। दूसरा, वे परिष्कृत विशेष उपकरण और तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है । तीसरा, वे बाध्यकारी की सीमा को अधिक आंक सकते हैं क्योंकि वे प्रोटीन के बीच सीआईएस और ट्रांस इंटरैक्शन दोनों के लिए अनुमति देते हैं जो स्वाभाविक रूप से वीवो में एक झिल्ली के लिए सीमित होते हैं। यहां हम एक सरल और अपेक्षाकृत तेजी से परख का प्रस्ताव करते हैं जो विशेष रूप से ट्रांस इंटरैक्शन का परीक्षण करता है।
शुद्ध प्रोटीन परख से जुड़ी कई जटिलताओं को दरकिनार करने के लिए, हमने एक सेल-आधारित प्रोटीन इंटरैक्शन परख को अनुकूलित किया है जो कम विषम कोशिका प्रणाली में ट्रांस इंटरैक्शन को पुनः प्राप्त करता है। इस परख का उपयोग पहले विभिन्न रूपों में ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस दृष्टिकोण में, उम्मीदवार सेल आसंजन अणु एचईके 293T कोशिकाओं में संक्रमित होते हैं। शारीरिक स्थितियों में, HEK293T कोशिकाएं आत्म-एकत्रीकरण का प्रदर्शन नहीं करती हैं, जिससे वे इस परख के लिए अनुकरणीय मॉडल बनाते हैं। हालांकि, जब रिसेप्टर और लिगांड व्यक्त करने वाली एचईके कोशिकाओं की व्यक्तिगत आबादी को संयुक्त किया जाता है, तो रिसेप्टर के बंधन और लिगांड एचईके कोशिकाओं के एकत्रीकरण को होते हैं। यह एकत्रीकरण विशेष रूप से ट्रांस इंटरैक्शन द्वारा मध्यस्थता की जाती है और आमतौर पर दसियों मिनट में नमूदार होती है। इस विधि में कोई प्रोटीन शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता नहीं है, और विधि की दक्षता प्रतिमान पर निर्भर करती है कि एचईसी कोशिकाओं की आबादी को अनुग्नक आसंजन अणुओं को व्यक्त किया जा रहा है और फिर बाद में केवल दसियों मिनट की कल्पना की जा रही है। इसके अतिरिक्त, यह विधि अपेक्षाकृत सस्ती है, क्योंकि न तो एंटीबॉडी और न ही महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। डेटा के अधिग्रहण के लिए आवश्यक एकमात्र उपकरण एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप है। इस सेल आधारित परख के लिए एक अतिरिक्त लाभ ट्रांस इंटरैक्शन पर रोग प्रासंगिक बिंदु म्यूटेशन के प्रभाव को जल्दी से स्क्रीन करने की क्षमता है। यह ब्याज के प्रोटीन के उत्परिवर्ती वेरिएंट के सीडीएनए के साथ एचईके कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करके किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक उदाहरण पेश करते हैं जिसमें हम जांच करते हैं कि क्या गहन बौद्धिक विकलांगता और मिर्गी के साथ निदान किए गए रोगी में पहचाने जाने वाले नेयूरेक्सिन3α (Neurexin3αA687T)में एक मिसेंस उत्परिवर्तन, ल्यूसिन-समृद्ध दोहराने वाले ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 2 (LRRTM2) के साथ ट्रांस में बातचीत को बदल देता है। Neurexin3α presynaptic सेल-आसंजन अणुओं के विकासवादी संरक्षित परिवार का एक सदस्य है और जबकि हाल के काम ने सिनैप्स3,4,5,6,7में कई भूमिकाओं की पहचान की है, इस अणु की हमारी सिनैप्टिक समझ और नेरेक्सिन परिवार के सभी सदस्य अधूरे रहते हैं। एलआरआरटीएम2 एक उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक सेल आसंजन प्रोटीन है जो 8 ,9,10सिनैप्सगठन और रखरखाव में भाग लेता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि LRRTM2 विशेष रूप से नेरेक्सिन आइसोफॉर्म के साथ बातचीत करता है जिसमें स्प्लिस साइट 4 वैकल्पिक एक्सॉन (एसएस 4-) की कमी है, लेकिन स्प्लिस साइट 4 वैकल्पिक एक्सोन (SS4 +) वाले नेयूरेक्सिन आइसोफॉर्म के साथ नहीं। Neurexin3α में पहचाना गया मानव मिसेंसे उत्परिवर्तन (A687T) एक अअयन्डाड एक्सट्रासेलुलर क्षेत्र में स्थित है जो विकासवादी रूप से संरक्षित है और सभी अल्फा नेयूरेक्सिन 7 के बीचसंरक्षितहै। जैसा कि इन दोनों अणुओं के बीच बातचीत8,9,11 स्थापितकी गई है, हमने प्रश्न पूछा: क्या A687T पॉइंट म्यूटेशन द्वारा बदल दिए गए एलआरआरटीएम2 के लिए Neurexin3α SS4 की बाध्यकारी क्षमता है? इस परख से पता चला है कि A687T बिंदु उत्परिवर्तन अप्रत्याशित रूप से Neurexin3α के एकत्रीकरण LRRTM2 को बढ़ाया सुझाव है कि बाह्राश क्षेत्र जिसमें बिंदु उत्परिवर्तन स्थित है, ट्रांससिनैप्टिक बातचीत मध्यस्थता में एक भूमिका निभाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल आसंजन के दौरान ट्रांस में होने वाले प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को विच्छेदन करने से परिपक्वता और पुनर्मॉडलिंग के दौरान सिनेप्स के गठन, कार्य और रखरखाव सहित बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं में अंतर्न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेंटल हेल्थ (R00MH103531 और R01MH116901 से जेए) तक अनुदान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिसिन (T32GM007635 से एसआर) तक एक प्रीडॉक्टोरल ट्रेनिंग ग्रांट और एडवांस्ड स्टडी (GT11021 से S.R.) के लिए एक Lyda हिल गिलम फैलोशिप (GT11021 से S.R.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम माइक्रोस्कोप के साथ मदद के लिए डॉ केविन वूलफ्रे, डॉ के उलरिच बायर को उनके एपिफ्लोर्सेंट माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं, और थॉमस Südhof (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) LRRTM2 plasmid के लिए ।
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
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