Måle transcellulære interaksjoner gjennom proteinaggregasjon i et heterologisk cellesystem
Summary
Her presenterer vi en optimalisert protokoll for raskt og semiquantitativt måle ligand-reseptor interaksjoner i trans i et heterologisk cellesystem ved hjelp av fluorescens mikroskopi.
Abstract
Proteininteraksjoner ved cellulære grensesnitt dikterer en rekke biologiske resultater som spenner fra vevsutvikling og kreftprogresjon til synapsedannelse og vedlikehold. Mange av disse grunnleggende interaksjonene forekommer i trans og induseres vanligvis av heterofile eller homofile interaksjoner mellom celler som uttrykker membran forankrede bindingspar. Belyse hvordan sykdomsrelevante mutasjoner forstyrrer disse grunnleggende proteininteraksjonene, kan gi innsikt i et mylder av cellebiologifelt. Mange protein-protein interaksjonsanalyser ikke vanligvis disambiguate mellom cis og trans interaksjoner, noe som potensielt fører til en overestimering av omfanget av binding som forekommer in vivo og involverer arbeidsintensiv rensing av protein og / eller spesialisert overvåkingsutstyr. Her presenterer vi en optimalisert enkel protokoll som muliggjør observasjon og kvantifisering av bare transinteraksjoner uten behov for lange proteinrensinger eller spesialisert utstyr. HEK-celleaggregasjonsanalysen innebærer blanding av to uavhengige populasjoner av HEK-celler, som hver uttrykker membranbundne kognatligander. Etter en kort inkubasjonsperiode blir prøvene avbildet og de resulterende aggregatene kvantifiseres.
Introduction
Synaptiske interaksjoner tilrettelagt av synaptiske vedheftmolekyler er grunnleggende for utvikling, organisasjon, spesifikasjon, vedlikehold og funksjon av synapser og generering av nevrale nettverk. Identifiseringen av disse transsynaptiske celleadhesjonsmolekylene øker raskt; Dermed er det fundamentalt viktig å identifisere bindende partnere og forstå hvordan disse nye vedheftmolekylene samhandler med hverandre. I tillegg har genomsekvensering identifisert mutasjoner i mange av disse vedheftmolekylene som vanligvis er knyttet til en rekke nevroutviklings-, nevropsykiatriske og avhengighetsforstyrrelser1. Mutasjoner i gener som kode for synaptiske celle-vedheftmolekyler kan endre transinteraksjoner negativt og kan bidra til patofysilogiske endringer i synapsedannelse og eller vedlikehold.
Flere analyser eksisterer for å kvantitativt vurdere protein-protein interaksjoner som isotermisk kalorimetri, sirkulær diktoisme, overflateplasmon resonans2 og selv om kvantitative i naturen, de har flere begrensninger. Først krever de rekombinant protein, noen ganger krevende lange og kjedelige rensetrinn. For det andre krever de sofistikert spesialisert utstyr og teknisk ekspertise. For det tredje kan de overvurdere omfanget av binding, da de tillater både cis og transinteraksjoner mellom proteiner som er naturlig bundet til en membran in vivo. Her foreslår vi en enkel og relativt rask analyse som utelukkende tester transinteraksjoner.
For å omgå mange av komplikasjonene forbundet med rensede proteinanalyser, har vi optimalisert en cellebasert proteininteraksjonsanalyse som rekafulerer transinteraksjoner i et redusert heterologcellesystem. Denne analysen har tidligere blitt brukt i ulike former for å studere transcellulære interaksjoner. I denne tilnærmingen blir kandidatcelleadhesjonsmolekyler transfisert til HEK293T-celler. Ved fysiologiske forhold viser HEK293T-celler ikke selvaggregering, noe som gjør dem eksemplariske modeller for denne analysen. Men når individuelle populasjoner av HEK-celler som uttrykker reseptor og ligand kombineres, binder reseptoren og ligand aggregering av HEK-celler til å forekomme. Denne aggregeringen medieres utelukkende av transinteraksjoner og kan vanligvis observeres om titalls minutter. Ingen proteinrensingstrinn er nødvendig i denne metoden, og effektiviteten av metoden er avhengig av paradigmet om at populasjoner av HEK-celler som uttrykker cognate adhesjonsmolekyler blir kombinert og deretter avbildet bare titalls minutter senere. I tillegg er denne metoden relativt billig, da verken antistoffer eller kostbart utstyr er nødvendig. Det eneste utstyret som kreves for innhenting av data er et standard fluorescerende mikroskop. En ekstra fordel med denne cellebaserte analysen er evnen til raskt å screene effekten av sykdomsrelevante punktmutasjoner på transinteraksjoner. Dette kan utføres ved å transfecting HEK celler med cDNAs av mutant varianter av protein av interesse.
I denne protokollen presenterer vi et eksempel der vi undersøker om en missense mutasjon i Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identifisert hos en pasient diagnostisert med dyp utviklingshemming og epilepsi, endrer interaksjoner i trans med leucinrikt gjentatt transmembraneprotein 2 (LRRTM2). Neurexin3α er medlem av den evolusjonære bevarte familien av presynaptiske celle-adhesjonmolekyler, og mens nylig arbeid har identifisert flere roller på synapse3,4,5,6,7, vår synaptiske forståelse av dette molekylet og alle medlemmer av neurexinfamilien forblir ufullstendige. LRRTM2 er et ekstiende postsynaptisk celleadhesjonsprotein som deltar i synapsedannelseog vedlikehold 8,9,10. Viktigere, LRRTM2 samhandler utelukkende med neurexin isoformer som mangler skjøte området 4 alternativ exon (SS4-), men ikke med neurexin isoformer som inneholder skjøte området 4 alternativ exon (SS4 +). Den menneskelige missense mutasjon (A687T) identifisert i Neurexin3α ligger i en uprudert ekstracellulær region som er evolusjonært bevart og bevares mellom alle alfa neurexins7. Som samspillet mellom disse to molekylene eretablert 8,9,11, stilte vi spørsmålet: er bindingsevnen til Neurexin3α SS4- til LRRTM2 endret av en A687T punkt mutasjon? Denne analysen viste at A687T-punktmutasjonen uventet forbedret aggregeringen av Neurexin3α til LRRTM2 som tyder på at den ekstracellulære regionen der punktmutasjonen ligger, spiller en rolle i å mediere transsynaptiske interaksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dissekere protein-protein interaksjoner som oppstår i trans under celle vedheft kan føre til en bedre forståelse av molekylære mekanismer underliggende grunnleggende cellulære prosesser inkludert dannelse, funksjon og vedlikehold av synapser under modning og ombygging. Implikasjonene av celle-til-celle interaksjoner utvide utover nevrobiologi og har bredere roller i signaltransduksjon, cellemigrasjon og vev utvikling14. Avvik i celleamhesjon kan forstyrre cellulære prosesser som er avgjøren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Grants fra National Institute of Mental Health (R00MH103531 og R01MH116901 til J.A.), en predoktorisk opplæring Stipend fra National Institute of General Medicine (T32GM007635 til S.R.), og en Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 til S.R.). Vi takker Dr. Kevin Woolfrey for hjelp med mikroskopet, Dr. K Ulrich Bayer for bruk av hans epifluorescent mikroskop, og Thomas Südhof (Stanford University) for LRRTM2 plasmid.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
