Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation
Summary
Denne protokol genererer mesh-formet manipuleret hjertevæv, der indeholder hjerte-kar-celler stammer fra humane inducerede pluripotente stamceller til at tillade undersøgelse af celle implantation terapi for hjertesygdomme.
Abstract
Den nuværende protokol beskriver metoder til at generere skalerbare, mesh-formede manipuleret hjertevæv (ECTs) bestående af hjerte-kar-celler fremstillet af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC), som er udviklet mod målet om klinisk brug. HiPSC-afledte kardiomyocytter, endotelceller og vaskulære vægmalericeller blandes med gelmatrix og hældes derefter i en polydimethylsiloxan (PDMS) vævsform med rektangulære interne forskudte stolper. Ved kulturdag 14 ECT’er modnes til en 1,5 cm x 1,5 cm mesh struktur med 0,5 mm diameter myofiber bundter. Kardiomyocytter tilpasse sig den lange akse af hvert bundt og spontant slå synkront. Denne fremgangsmåde kan skaleres op til en større (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT og samtidig bevare konstruktørning og funktion. Således kan mesh-formede ECTs genereret fra hiPSC-afledte hjerteceller være muligt for hjerteregenerering paradigmer.
Introduction
Talrige prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg har bekræftet effektiviteten af cellebaserede hjertegenerative behandlinger for svigtende hjerter1,,2,,3. Blandt forskellige celletyper, humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) er lovende cellekilder i kraft af deres proliferative evne, potentiale til at generere forskellige hjerte-kar-slægter4,5, og allogenicitet. Desuden har vævsteknik teknologier gjort det muligt at overføre millioner af celler på etbeskadigethjerte 5,6,,7,8.
Tidligere rapporterede vi generation af tre-dimensionelle (3D) lineær manipuleret hjertevæv (ECTs) fra hiPSC-afledte hjerte-kar-slægter ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kultursystem til 3D bioartificialt væv5,7. Vi fandt, at sameksistensen af vaskulære endotelceller og vægmaleri celler med kardiomyocytter inden for ECT lettet strukturelle og elektrofysiologiske væv modning. Desuden validerede vi det terapeutiske potentiale af implanterede hiPSC-ECT’er i en immuntolerant rotte myokardieinfarkt model for at forbedre hjertefunktionen, regenerere myokardiet og forbedre angiogenese5. De lineære ECT’er, der blev fremstillet ved denne metode, var imidlertid 1 mm med 10 mm cylindre og var derfor ikke egnede til implantation i prækliniske undersøgelser med større dyr eller klinisk anvendelse.
Baseret på en vellykket brug af væv forme til at generere porøse manipuleret væv dannelse ved hjælp af rotte skelet myoblaster og cardiomyocytes9, humane ESC-afledte cardiomyocytes10 og mus iPSCs11, vi udviklet en protokol til at generere skalerbare hiPSC-afledte større implantable væv ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) forme. Vi evaluerede en række skimmelgeometrier for at bestemme de mest effektive mugegenskaber. Mesh-formede ECT’er med flere bundter og vejkryds udviste fremragende egenskaber i celle levedygtighed, vævsfunktion og skalerbarhed sammenlignet med plain-sheet eller lineære formater, der manglede porer eller vejkryds. Vi implanterede den mesh-formede ECT i en rotte myokardieinfarkt model og bekræftede dens terapeutiske virkninger svarende til implanterede cylindriske ECT’er12. Her beskriver vi protokollen til at generere en hiPSC-afledt mesh-formet ECT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter afslutningen af vores undersøgelse af et lineært format, hiPSC afledt ECT5, tilpassede vi protokollen til at blande hiPSC-afledte CMs, ECs og MC’er for at lette in vitro-udvidelse af vaskulære celler i ECT’er og efterfølgende in vivo vaskulær kobling mellem ECT’er og recipient myocardium.
For at lette genereringen af større, implantable mesh ECT-geometrier brugte vi tynde PDMS-plader til at designe 3D-formene med lastningspæle, der var opstillet i forskudte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet økonomisk af Kosair Charities Pediatric Heart Research Program ved University of Louisville og Organoid Project på RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSCs anvendes i vores offentliggjorte protokoller blev leveret af Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referências
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
