Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair
Summary
Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.
Abstract
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het genereren van schaalbare, mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels (ECT’s) samengesteld uit cardiovasculaire cellen afkomstig van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s), die zijn ontwikkeld naar het doel van klinisch gebruik. HiPSC-afgeleide cardiomyocyten, endotheelcellen en vasculaire muurschilderingcellen worden gemengd met gelmatrix en vervolgens gegoten in een polydimethylsiloxane (PDMS) weefselmal met rechthoekige interne gespreide palen. Op cultuurdag 14 ECT’s vervallen in een 1,5 cm x 1,5 cm mesh structuur met 0,5 mm diameter myofiber bundels. Cardiomyocyten stemmen op de lange as van elke bundel en slaan spontaan synchroon. Deze aanpak kan worden opgeschaald naar een grotere (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT met behoud van de bouw rijping en functie. Zo kunnen mesh-vormige ECT’s gegenereerd uit hiPSC-afgeleide hartcellen haalbaar zijn voor cardiale regeneratieparadigma’s.
Introduction
Talrijke preklinische studies en klinische studies hebben de efficiëntie van op cellen gebaseerde hartregeneratieve therapieën voor falende harten1,2,3bevestigd . Onder verschillende celtypen, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) zijn veelbelovende celbronnen op grond van hun proliferative vermogen, potentieel om verschillende cardiovasculaire afstammingen4,,5, en allogene te genereren. Bovendien hebben weefseltechnische technologieën het mogelijk gemaakt om miljoenen cellen over te brengen op een beschadigd hart5,6,7,8.
Eerder rapporteerden we de generatie van driedimensionale (3D) lineair ontworpen hartweefsels (ECT’s) uit hiPSC-afgeleide cardiovasculaire afstammingen met behulp van een commercieel beschikbaar kweeksysteem voor 3D biokunstweefsels5,7. We ontdekten dat de coëxistentie van vasculaire endotheelcellen en muurschilderingcellen met cardiomyocyten binnen de ECT structurele en elektrofysiologische weefselrijping vergemakkelijkte. Bovendien hebben we het therapeutisch potentieel van geïmplanteerde hiPSC-ECT’s gevalideerd in een immuuntolerante rat hartinfarct model om de hartfunctie te verbeteren, myocardium te regenereren en angiogenese5te verbeteren. De lineaire ECT’s die met deze methode werden geconstrueerd, waren echter 1 bij 10 mm cilinders en dus niet geschikt voor implantatie in preklinische studies met grotere dieren of klinisch gebruik.
Op basis van het succesvolle gebruik van weefselmallen om poreuze weefselvorming te genereren met behulp van rat skeletmyoblasten en cardiomyocyten9, menselijke ESC-afgeleide cardiomyocyten10 en muis iPSCs11, ontwikkelden we een protocol voor het genereren van schaalbare hiPSC-afgeleide grotere implanteerbare weefsel met behulp van polydimethylsiloxane (PDMS) mallen. We evalueerden een reeks schimmelgeometrieën om de meest effectieve schimmelkenmerken te bepalen. Mesh-vormige ECT’s met meerdere bundels en knooppunten vertoonden uitstekende kenmerken in celconsistenties, weefselfunctie en schaalbaarheid in vergelijking met gewone of lineaire formaten die poriën of knooppunten misten. We implanteerden de mesh-vormige ECT in een rat hartinfarct model en bevestigde de therapeutische effecten vergelijkbaar met geïmplanteerde cilindrische ECTs12. Hier beschrijven we het protocol om een hiPSC-afgeleide mesh-vormige ECT te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na de voltooiing van ons onderzoek naar een lineair formaat, hiPSC afgeleid ECT5, hebben we het protocol aangepast om hiPSC-afgeleide CMs, MC’s en MC’s te mengen om de in vitro expansie van vasculaire cellen binnen ECT’s en de daaropvolgende in vivo vasculaire koppeling tussen ECT’s en ontvanger myocardium te vergemakkelijken.
Om het genereren van grotere, implanteerbare mesh ECT-geometrieën te vergemakkelijken, hebben we dunne PDMS-platen gebruikt om de 3D-mallen te o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door het Kosair Charities Pediatric Heart Research Program van de Universiteit van Louisville en het Organoid Project van het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSC’s die in onze gepubliceerde protocollen werden gebruikt, werden geleverd door het Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referências
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
