वीवो मायोकार्डियल रिपेयर में मानव आईपीएस कोशिकाओं से प्राप्त मेष के आकार के इंजीनियर कार्डियक ऊतकों की तैयारी
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल हृदय रोगों के लिए कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा की जांच की अनुमति देने के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त हृदय कोशिकाओं से युक्त जाल के आकार के इंजीनियर हृदय ऊतक उत्पन्न करता है ।
Abstract
वर्तमान प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) से प्राप्त हृदय कोशिकाओं से बना स्केलेबल, जाल के आकार के इंजीनियर हृदय ऊतकों (ईसीटी) उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है, जो नैदानिक उपयोग के लक्ष्य की दिशा में विकसित किए जाते हैं। हिप्ससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, और संवहनी भित्ति कोशिकाओं को जेल मैट्रिक्स के साथ मिलाया जाता है और फिर आयताकार आंतरिक कंपित पदों के साथ पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) ऊतक मोल्ड में डाला जाता है। संस्कृति दिवस तक 14 ईसीटी 0.5 मिमी व्यास मायोफाइबर बंडलों के साथ 1.5 सेमी x 1.5 सेमी जाल संरचना में परिपक्व होता है। कार्डियोमायोसाइट्स प्रत्येक बंडल की लंबी धुरी के अनुरूप होते हैं और अनायास ही समकालिक रूप से हरा देते हैं। इस दृष्टिकोण को निर्माण परिपक्वता और कार्य को संरक्षित करते हुए एक बड़े (3.0 सेमी x 3.0 सेमी) जाल ईसीटी तक बढ़ाया जा सकता है। इस प्रकार, एचआईपीसी-व्युत्पन्न हृदय कोशिकाओं से उत्पन्न जाल के आकार का ईसीटी हृदय उत्थान प्रतिमान के लिए संभव हो सकता है।
Introduction
कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों और नैदानिक परीक्षणों ने असफल दिलों के लिए सेल आधारित कार्डियक पुनर्योजी उपचारों की दक्षता की पुष्टि की है1,2,,3. विभिन्न सेल प्रकारों में, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) उनकी प्रसार क्षमता, विभिन्न हृदय वंश4,,5,और एलोजेनिकिटी उत्पन्न करने की क्षमता के आधार पर सेल स्रोतों का वादा कर रहे हैं। इसके अलावा, टिश्यू इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों ने लाखों कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त हृदय5,6,,,7,,8पर स्थानांतरित करना संभव बना दिया है।
इससे पहले, हमने 3 डी बायोआर्टिफिशियल ऊतकों5,,7के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके हिप्ससी-व्युत्पन्न हृदय वंश से त्रि-आयामी (3 डी) रैखिक इंजीनियर कार्डियक ऊतकों (ईसीटी) की पीढ़ी की सूचना दी। हमने पाया कि ईसीटी के भीतर कार्डियोमायोसाइट्स के साथ वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और भित्ति कोशिकाओं के सह-अस्तित्व ने संरचनात्मक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल ऊतक परिपक्वता की सुविधा प्रदान की। इसके अलावा, हमने कार्डियक फ़ंक्शन में सुधार करने, मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करने और एंजियोजेनेसिस5को बढ़ाने के लिए एक प्रतिरक्षा सहिष्णु चूहा मायोकार्डियल इंफार्क्शन मॉडल में प्रत्यारोपित एचआईपीएससी-ईसीटी की चिकित्सीय क्षमता को मान्य किया। हालांकि, इस विधि द्वारा निर्मित रैखिक ईसीटी 10 मिमी सिलेंडरों द्वारा 1 मिमी थे और इसलिए बड़े जानवरों या नैदानिक उपयोग के साथ प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं थे।
चूहे कंकाल मायोब्लास्ट और कार्डियोमायोसाइट्स9,मानव ईएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स 10 और माउस आईपीएससी11 का उपयोग करके असुरक्षित इंजीनियर ऊतकगठनउत्पन्न करने के लिए ऊतक मोल्डों के सफल उपयोग के आधार पर, हमने पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोल्डों का उपयोग करके स्केलेबल हिप्ससी-व्युत्पन्न बड़े प्रत्यारोपण ऊतक उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। हमने सबसे प्रभावी मोल्ड विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए मोल्ड ज्यामिति की एक श्रृंखला का मूल्यांकन किया। कई बंडलों और जंक्शनों के साथ मेष के आकार का ईसीटी सादे चादर या रैखिक प्रारूपों की तुलना में सेल व्यवहार्यता, ऊतक समारोह और स्केलेबिलिटी में उत्कृष्ट विशेषताओं का प्रदर्शन किया गया जिसमें छिद्रों या जंक्शनों की कमी थी। हमने एक चूहे मायोकार्डियल इंफार्क्शन मॉडल में जाल के आकार का ईसीई प्रत्यारोपित किया और प्रत्यारोपित बेलनाकार ईसीटी12के समान इसके चिकित्सीय प्रभावों की पुष्टि की। यहां हम एक hiPSC-व्युत्पन्न जाल के आकार का ECT उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक रैखिक प्रारूप की हमारी जांच के पूरा होने के बाद, hiPSC व्युत्पन्नECT 5,हमने ईसीटी और प्राप्तकर्ता मायोकार्डियम के बीच वीवो वैस्कुलर कपलिंग में ईसीटी के भीतर संवहनी कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को लुइसविले विश्वविद्यालय में कोसैयर चैरिटी पीडियाट्रिक हार्ट रिसर्च प्रोग्राम और रिकोन सेंटर फॉर बायोसिस्टम्स डायनेमिक्स रिसर्च में ऑर्गेनॉइड प्रोजेक्ट द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था। हमारे प्रकाशित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले HiPSCs को सेंटर फॉर आईपीएस सेल रिसर्च एंड एप्लीकेशन, क्योटो विश्वविद्यालय, क्योटो, जापान द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referências
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