Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo
Summary
L’attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo per consentire lo studio della terapia dell’impianto cellulare per le malattie cardiache.
Abstract
L’attuale protocollo descrive i metodi per generare tessuti cardiaci ingegnerizzati scalabili a forma di mesh (ET) composti da cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC), che vengono sviluppate verso l’obiettivo dell’uso clinico. I cardiomiociti derivati dall’HiPSC, le cellule endoteliali e le cellule murali vascolari vengono mescolati con la matrice gel e poi versati in uno stampo di tessuto polidimetlsiloxane (PDMS) con post interni rettangolari sfalsati. Entro il giorno della coltura 14 ET maturano in una struttura a maglia di 1,5 cm x 1,5 cm con fasci di miofibera di 0,5 mm di diametro. I cardiomiociti si allineano all’asse lungo di ogni fascio e battono spontaneamente in modo sincrono. Questo approccio può essere scalato fino a una mesh più grande (3,0 cm x 3,0 cm) ECT, preservando la maturazione e la funzione del costrutto. Pertanto, le ECT a forma di mesh generate da cellule cardiache derivate da hiPSC possono essere fattibili per i paradigmi di rigenerazione cardiaca.
Introduction
Numerosi studi preclinici e studi clinici hanno confermato l’efficienza delle terapie cardiogenerative a base cellulare per i cuoriche hanno mancato di cuore 1,2,3. Tra i vari tipi di cellule, le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) sono promettenti fonti cellulari in virtù della loro capacità prolifertiva, potenziale per generare varie linee cardiovascolari4,5e allogenicità. Inoltre, le tecnologie di ingegneria tissu/tessuto hanno reso possibile il trasferimento di milioni di cellule su un cuoredanneggiato 5,6,7,8.
In precedenza, abbiamo segnalato la generazione di tessuti cardiaci lineari (ECT) tridimensionali (3D) da linee cardiovascolari derivate da hiPSC utilizzando un sistema di coltura disponibile in modo commerciale per i tessuti bioartifici3D 5,7. Abbiamo scoperto che la coesistenza di cellule endoteliali vascolari e cellule murali con cardiomiociti all’interno dell’ECT ha facilitato la maturazione strutturale ed elettrofisiologica dei tessuti. Inoltre, abbiamo convalidato il potenziale terapeutico dell’hiPSC-ECT impiantato in un modello di infarto miocardico tollerante all’immunita’ per migliorare la funzione cardiaca, rigenerare il miocardio e migliorare l’angiogenesi5. Tuttavia, le ECT lineari costruite con questo metodo erano cilindri da 1 mm per 10 mm e quindi non adatti per l’impianto in studi preclinici con animali più grandi o uso clinico.
Sulla base dell’uso riuscito di stampi tisssidali per generare formazione di tessuto ingegnerizzato poroso utilizzando myoblast scheletrici e cardiomiocitischeletrici 9, cardiomiociti umani derivati da ESC10 e iPSC del topo11, abbiamo sviluppato un protocollo per generare tessuti impiantabili più grandi derivati da hiPSC scalabili utilizzando stampi polidimetillsiloxane (PDMS). Abbiamo valutato una gamma di geometrie di stampo per determinare le caratteristiche di stampo più efficaci. Le ET a forma di mesh con più fasci e giunzioni hanno mostrato eccellenti caratteristiche nella vitalità cellulare, nella funzione dei tessuti e nella scalabilità rispetto ai formati semplici o lineari privi di pori o giunzioni. Abbiamo impiantato l’ECT a forma di maglia in un modello di infarto miocardico e abbiamo confermato i suoi effetti terapeutici simili agli ECT cilindriciimpiantati 12. Qui descriviamo il protocollo per generare un ECT a forma di mesh derivato da hiPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopo il completamento della nostra indagine su un formato lineare, derivato da hiPSC ECT5, abbiamo adattato il protocollo per mescolare CIC, EC e MC derivati da hiPSC per facilitare l’espansione in vitro delle cellule vascolari all’interno delle ECT e il successivo accoppiamento vascolare in vivo tra ECT e miocardio ricevente.
Per facilitare la generazione di geometrie ECT mesh più grandi e impiantabili abbiamo usato sottili fogli PDMS per progettare gli stampi 3D con …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Kosair Charities Pediatric Heart Research Program presso l’Università di Louisville e dal Progetto Organoid presso il RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Gli HiPSC utilizzati nei nostri protocolli pubblicati sono stati forniti dal Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Giappone.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referências
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