生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製
Summary
本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来の心血管細胞を含むメッシュ状の人工心臓組織を生成し、心臓病の細胞移植療法の調査を可能にする。
Abstract
現在のプロトコルは、臨床使用の目標に向けて開発されたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来する心血管細胞で構成されるスケーラブルなメッシュ状の人工心臓組織(EEC)を生成する方法を記述しています。HiPSC由来の心筋細胞、内皮細胞、および血管壁画細胞をゲルマトリックスと混合し、長方形の内部ずらしたポストを有するポリジメチルシロキサン(PDMS)組織型に注ぎ込む。培養日までに14 ETは直径0.5mmのミオファイバーバンドルを持つ1.5 cm x 1.5 cmのメッシュ構造に成熟する。心筋細胞は各バンドルの長軸に整列し、自発的に同期的に拍動する。このアプローチは、構築成熟と機能を維持しながら、より大きな(3.0 cm x 3.0 cm)メッシュECTまでスケールアップすることができます。したがって、hiPSC由来の心臓細胞から生成されるメッシュ状のETは、心臓再生パラダイムに対して実現可能であり得る。
Introduction
数多くの前臨床試験および臨床試験は、心不全の心臓11、2、32のための細胞ベースの心臓再生療法の効率を3確認した。様々な細胞タイプの中で、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)は増殖能により有望な細胞源であり、種々の心血管系統44、5、5および同種性を発生させる可能性がある。さらに、組織工学技術により、損傷を受けた心臓5、6、7、86,に何5百万もの細胞を移すことを可能に7,しました。
以前は、3D人工組織,5,7に対する市販の培養システムを用いてhiPSC由来の心血管系から3次元(3D)線形心臓組織(EEC)の生成を報告した。5この結果、血管内皮細胞と心筋細胞との共存が、構造・電気生理学的組織成熟を促進することがわかった。さらに、免疫寛容ラット心筋梗塞モデルに移植されたhiPSC-ETの治療可能性を検証し、心機能を改善し、心筋を再生し、血管新生を増強する5。しかし、この方法で構築された線形ETは1mm×10mmシリンダーであったため、より大きな動物や臨床使用の前臨床試験における移植には適していなかった。
ラット骨格筋芽細胞および心筋細胞9、ヒトESC由来心筋細胞10およびマウスiPSCs11を用いて組織鋳型を使用して多孔質組織形成を生み出すことを成功させた結果、ポリジ11メチルシロキサン(PDMS)型を用いてスケーラブルなhiPSC由来の埋め込み型組織を生成するプロトコルを開発した。金型の形状を評価し、最も有効な金型特性を決定しました。複数のバンドルと接合部を持つメッシュ状のETは、毛穴や接合部を欠いた平素シートまたは線形フォーマットと比較して、細胞の生存率、組織機能および拡張性において優れた特性を示しました。我々は、ラット心筋梗塞モデルにメッシュ状のECTを移植し、その治療効果を、移植された円筒形ECT12と同様に確認した。ここでは、hiPSC 派生メッシュ型 ECT を生成するプロトコルについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
線形形式の調査が完了した後、hiPSC由来のECT5は、HiPSC由来のCM、IC、およびMCを混合して、ECT内の血管細胞のインビトロ拡張とその後のECTとレシピエント心筋の間のインビボ血管結合を容易にするプロトコルを適応させた。
より大きく埋め込み型メッシュECT形状の生成を容易にするために、薄いPDMSシートを使用して、3D金型を設計し、荷重ポストをずらし…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ルイビル大学のコセア・チャリティー小児心臓研究プログラムと理化学研究所生物系ダイナミクス研究センターのオルガノイドプロジェクトによって財政的に支援されました。公開されたプロトコルで使用されているHiPSCは、京都大学iPS細胞研究応用センターが提供しました。
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referências
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