작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석
Summary
이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.
Abstract
폴리뉴클레오티드 키나아제(PNKs)는 DNA와 RNA 올리고뉴클레오티드의 5′ 하이드록실 끝의 인산화를 촉매하는 효소이다. PNK의 활동은 직접 또는 간접 접근 방식을 사용하여 정량화될 수 있습니다. 여기에 제시된 형광표지 올리고뉴클레오티드 기판 및 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의존하는 PNK 활성을 측정하는 직접적인 시험관내 접근법이 여기에 제시된다. 이 방법은 무선 표지기기의 사용을 피하면서 인산 제품의 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜은 인산화 반응을 설정하고, 대형 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고, 반응 제품을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 분석의 가장 기술적으로 도전적인 부분은 큰 폴리 아크릴 아미드 젤을 붓고 실행하는 것입니다; 따라서 공통의 어려움을 극복하기 위한 중요한 세부 사항이 제공됩니다. 이 프로토콜은 Grc3, 결합 파트너, Las1 nuclease와 의무 사전 리보소말 RNA 처리 복합체로 조립 하는 PNK에 대 한 최적화 되었다. 그러나, 이 프로토콜은 다른 PNK 효소의 활성을 측정하도록 적응될 수 있다. 더욱이, 이러한 분석은 또한 뉴클레오시드 삼위산염, 금속 이온 및 올리고뉴클레오티드와 같은 반응의 상이한 성분의 효과를 결정하기 위해 수정될 수 있다.
Introduction
폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)는 DNA 수리 및 리보솜 어셈블리1,,2,,3,,4,,5와같은 많은 DNA 및 RNA 처리 경로에서 중요한 역할을 한다. 이러한 근본적인 효소는 뉴클레오시드 삼위산염(NTP, 가장 자주 ATP)에서 뉴클레오티드 기판의 5′ 하이드록실 끝으로 의 단말(감마) 단포산염의 전달을 촉매한다. 가장 잘 특징적인 PNK 중 하나는 광범위한 기판 특이성을,가지며 DNA 또는 RNA 기판,6,,7, 7,8,9,10,,911,,12의5종에 방사성 동위원소 라벨을 통합하기 위한 분자 생물학 실험실에서 크게 활용되는 박테리오파지 T4 PNK이다. PNK 효소의 또 다른 예는 EUKarya, 유박테리아 및 고고학에서 발견되는 CLP1이며, 여러 RNA 처리 경로4,,,13,14,,15에연루된다.
역사적으로, 폴리뉴클레오티드 키나아제 활성을 측정하는 대부분의 분석체는 방사성 동위원소 라벨링 및 후속 사인 방사선 촬영5,,16에의존한다. 최근에는 단일 분자 접근법, 마이크로칩 전기포전, 분자 비콘, 색색 및 발광 계분석17,,18,,19,,20,,21,,22를포함한 PNK 활성을 측정하기 위해 다수의 추가 분석이 개발되었다. 이러한 새로운 접근 방식의 대부분은 향상된 검출 한계를 제공하고 방사능 사용을 피할 수 있지만, 각각은 비용, 고정 수지에 대한 의존, 기판 선택의 한계와 같은 단점이 있습니다.
Grc3은 프리 리보소말 RNA,2,3,323의처리에 중추적인 역할을 하는 폴리뉴클레오티드 키나아제이다. Grc3은 사전 리보소말 RNA3의내부 전사 스페이서 2 (ITS2)를 갈라엔엔토리코나클레스 Las1을 갖춘 의무 복합체를 형성한다. ITS2의 골짜기는 Grc3 키나아제3에의해 인광되는 5′ 하이드록실을 수용하는 제품을 생성한다. Grc3의 뉴클레오티드 및 기판 특이성을 조사하기 위해서는 상이한 올리고뉴클레오티드 기판의 테스트를 허용한 저렴한 분석이 필요했습니다. 따라서 형광 표지기기판을 이용한 PNK 인산화 분석이 개발되었다. 이 분석체는 Grc3이 인산화균 전송 활동에 대한 NTP를 활용할 수 있지만 ATP24를선호한다는 것을 확인하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 프로토콜은 본래 분석체를 조정하여 그 전 리보소말 RNA 기판(SC-ITS2, 표 1)의RNA 모방에 대한 Grc3의 PNK 활성을 측정한다. 이 형광 기반 접근의 한 가지 도전적인 측면은 효과적으로 인광 및 비인포인화 기판을 해결하기 위해 큰 폴리 아크라이알라미드 젤에 의존하는 것입니다. 이 프로토콜은 이러한 큰 젤을 붓고 그렇게 할 때 일반적인 함정을 피하는 방법에 대한 구체적인 세부 정보를 제공합니다.
RNA로 일하는 것은 저하에 강하게 영향을 받기 쉽기 때문에 특별한 주의가 필요합니다. ribonuclease 오염을 제한하기 위해 취할 수있는 간단한 예방 단계가 있습니다. RNase 억제제 함유 세정제로 쉽게 치료할 수 있는 별도의 RNA 워크스테이션이 종종 도움이 됩니다. 샘플을 취급하고 RNase가없는 인증 소모품을 사용할 때 항상 장갑을 착용해야합니다. 물은 오염의 또 다른 일반적인 소스이기 때문에, 0.22 μm 필터를 사용하여 갓 정제 된 물을 사용하고 모든 솔루션을 살균하는 것이 가장 좋습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 것은 형광표지 뉴클레오티드 기판에 Grc3 PNK의 키나아제 활성을 측정하는 분석이다. 이 프로토콜은 반응 버퍼 및 올리고뉴클레오티드 기판을 적응시킴으로써 다른 PNK 효소를 특성화하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어 프로토콜은 미량의 EDTA를 요구합니다. EDTA의 첨가는 두 가지 이유로 유익합니다: 첫째, 이 접근법은 효소가 혼합물에 있는 오염 금속의 미량에 결합하는 것을 방지해서 마?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
앤드류 시케마 박사와 안드레아 카민스키 박사에게 이 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 보건 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다; 미국 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS; ZIA ES103247 – R.E.S) 및 캐나다 보건 연구소 (CIHR; 146626 ~ M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
Referências
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Bioquímica. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
