Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Summary

L’iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Abstract

Le metastasi, la causa principale di morbilità e mortalità per la maggior parte dei malati di cancro, possono essere difficili da modellare preclinicamente nei topi. Sono disponibili pochi modelli di metastasi spontanee. Pertanto, il modello sperimentale di metastasi che coinvolge l’iniezione della vena caudale di linee cellulari adatte è un pilastro della ricerca sulle metastasi. Quando le cellule tumorali vengono iniettate nella vena laterale della coda, il polmone è il loro sito preferito di colonizzazione. Una potenziale limitazione di questa tecnica è la quantificazione accurata del carico tumorale polmonare metastatico. Mentre alcuni ricercatori contano macrometastasi di dimensioni predefinite e/o includono micrometastasi dopo il sezionamento del tessuto, altri determinano l’area delle lesioni metastatiche rispetto all’area tissutale normale. Entrambi questi metodi di quantificazione possono essere estremamente difficili quando il carico metastatico è elevato. Qui, dimostriamo un modello di iniezione endovenosa di metastasi polmonari seguito da un metodo avanzato per quantificare il carico tumorale metastatico utilizzando un software di analisi delle immagini. Questo processo consente di studiare più parametri end-point, tra cui la dimensione media delle metastasi, il numero totale di metastasi e l’area totale delle metastasi, per fornire un’analisi completa. Inoltre, questo metodo è stato esaminato da un patologo veterinario certificato dall’American College of Veterinary Pathologists (SEK) per garantire l’accuratezza.

Introduction

Nonostante sia un processo altamente complesso e ^{inefficiente1}, le metastasi contribuiscono in modo significativo alla morbilità e alla mortalità dei pazienti ^oncologici2. In effetti, la maggior parte dei decessi correlati al cancro sono attribuiti alla diffusione metastatica della ^malattia3,4. Affinché le cellule tumorali possano metastatizzare con successo, devono staccarsi dal sito primario, invadere attraverso lo stroma adiacente, intravasare la circolazione sanguigna o linfatica, viaggiare verso il letto capillare di un sito secondario, estravasare nel tessuto secondario e proliferare o crescere fino a formare lesioni metastatiche5. L’uso di modelli murini è stato fondamentale per promuovere la comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della semina e della crescita ^{metastatica6,7}. Qui ci concentriamo sulle metastasi del cancro al seno, per le quali vengono spesso utilizzati sia modelli murini geneticamente modificati che metodi di trapianto, ognuno con la propria serie di vantaggi e limitazioni.

I modelli di tumore mammario geneticamente modificati fanno uso di promotori specifici della ghiandola mammaria, tra cui MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) e WAP (Whey Acidic Protein), per guidare l’espressione dei transgeni nell’epitelio mammario8. Gli oncogeni tra cui l’antigene T medio del polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e il virus simian 40 (SV40) sono stati espressi in questo modo9,10,11,12,13, e mentre questi modelli genetici sono utili per studiare l’inizio e la progressione del tumore primario, pochi metastatizzano facilmente in organi distanti. Inoltre, questi modelli genetici murini sono spesso più proibitivi in termini di tempo e costi rispetto ai modelli di metastasi spontanee o sperimentali. Data la limitazione della maggior parte dei modelli di tumore mammario geneticamente modificati per studiare le metastasi, le tecniche di trapianto sono diventate metodi interessanti per studiare questo complesso processo. Ciò include l’iniezione ortotopica, della vena della coda, intracardiaca e intracranica di linee cellulari adatte.

Sebbene diverse linee cellulari di cancro al seno metastatizzino prontamente dopo l’iniezione ortotopica nel cuscinetto di grasso ^{mammario14,15}, la consistenza e la riproducibilità del carico tumorale metastatico può essere una sfida e la durata di tali studi può essere dell’ordine di diversi mesi. Per valutare le metastasi polmonari, in particolare, l’iniezione endovenosa nella vena della coda è spesso un metodo più riproducibile ed efficace nel tempo con diffusione metastatica che si verifica tipicamente nell’arco di poche settimane. Tuttavia, poiché il modello di iniezione endovenosa bypassa le fasi iniziali della cascata metastatica, è necessario prestare attenzione nell’interpretare i risultati di questi studi. In questa dimostrazione, mostriamo l’iniezione della vena caudale di cellule tumorali mammarie insieme a un metodo di analisi accurato e completo.

Anche se la comunità di ricerca ha compiuto progressi significativi nella comprensione del complesso processo delle metastasi del cancro al seno, si stima che oltre 150.000 donne abbiano attualmente il cancro al seno ^{metastatico16}. Di quelli con carcinoma mammario in stadio IV, >36% dei pazienti ha metastasi ^polmonari17; tuttavia, il modello sito-specifico e l’incidenza delle metastasi possono variare in base al sottotipo ^{molecolare18,19,20,21}. Le pazienti con metastasi polmonari associate al cancro al seno hanno una sopravvivenza mediana di soli 21 mesi, evidenziando la necessità di identificare trattamenti efficaci e nuovi biomarcatori per questa ^malattia17. L’uso di modelli sperimentali di metastasi, compresa l’iniezione endovenosa di cellule tumorali, continuerà a far progredire la nostra conoscenza di questa importante sfida clinica. Quando combinate con la patologia di imaging digitale e il metodo di analisi del carico tumorale polmonare metastatico descritto in questo protocollo, le iniezioni di vena caudale sono uno strumento prezioso per la ricerca sulle metastasi del cancro al seno.

Protocol

L’uso degli animali ha seguito i regolamenti dell’Università Laboratory Animal Resources (ULAR) nell’ambito del protocollo approvato dall’OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore). 1. Iniezione della vena della coda delle cellule del cancro al seno Preparazione di cellule e siringhe per iniezione Placcare un numero appropriato di cellule in base al numero di topi e alla concentrazione cellulare da utilizzare.NOTA: Il num…

Representative Results

Se si utilizzano cellule non etichettate per l’iniezione della vena della coda, può essere difficile confermare la colonizzazione polmonare fino a (1) il tempo dell’autopsia se si possono osservare macrometastasi o (2) dopo l’analisi istologica se esistono metastasi microscopiche. Con un ampio carico di tumore polmonare metastatico, i topi avranno faticato a respirare. Come con qualsiasi studio sul tumore, i topi devono essere attentamente monitorati per tutta la durata dello studio. L’uso di cellule marcate è un modo …

Discussion

Mentre i ricercatori continuano a utilizzare l’iniezione endovenosa di cellule tumorali come modello sperimentale per le metastasi, mancano pratiche standard per analizzare il carico tumorale metastatico risultante. In alcuni casi, differenze significative nel carico tumorale metastatico in caso di manipolazione di particolari linee cellulari e/o uso di composti chimici possono essere osservate macroscopicamente. Tuttavia, in altri casi, sottili differenze nella semina e nella crescita metastatica possono essere trascura…

Materials

alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	for cleaning tail prior to injection
dissection scissors	Fisher Scientific	08-951-5	for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	MT10013CV	cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Fisher Scientific	MT21030CV	used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution)	OSU		used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable
Evan's blue dye	Millipore Sigma	E2129	used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	F4135	cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps	Fisher Scientific	10-270	for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice	The Jackson Laboratory	001800	syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line)	Millipore Sigma	Z359629	for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G)	Fisher Scientific	14-829-1B	for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells	ATCC		human breast cancer cell line
MVT1 cells			mouse mammary tumor cells
needles (26 G)	Fisher Scientific	14-826-15	used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%)	Fisher Scientific	245685	used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x	ThermoFisher	15140163	cell culture media additive
sterile gauze	Fisher Scientific	NC9379092	for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL)	Fisher Scientific	14-955-458	used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer	Braintree Scientific, Inc.	TV-150 STD	used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %)	ThermoFisher	15250061	used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 %	ThermoFisher	25200-114	used in cell culture to detach tumor cells from plate