Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen
Summary
Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.
Abstract
Metastasen, die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei den meisten Krebspatienten, können bei Mäusen präklinisch zu modellieren sein. Es stehen nur wenige spontane Metastasenmodelle zur Verfügung. Somit ist das experimentelle Metastasenmodell mit Tail-Vein-Injektion geeigneter Zelllinien eine tragende Säule der Metastasenforschung. Wenn Krebszellen in die laterale Schwanzvene injiziert werden, ist die Lunge ihr bevorzugter Ort der Kolonisation. Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist die genaue Quantifizierung der metastasierenden Lungentumorbelastung. Während einige Forscher Makrometastasen einer vordefinierten Größe zählen und / oder Mikrometastasen nach dem Schneiden des Gewebes einschließen, bestimmen andere den Bereich der metastatischen Läsionen relativ zum normalen Gewebebereich. Beide Quantifizierungsmethoden können äußerst schwierig sein, wenn die metastatische Belastung hoch ist. Hierin demonstrieren wir ein intravenöses Injektionsmodell der Lungenmetastasierung, gefolgt von einer fortschrittlichen Methode zur Quantifizierung der metastasierenden Tumorbelastung unter Verwendung von Bildanalysesoftware. Dieser Prozess ermöglicht die Untersuchung mehrerer Endpunktparameter, einschließlich der durchschnittlichen Metastasengröße, der Gesamtzahl der Metastasen und des gesamten Metastasenbereichs, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde diese Methode von einem Veterinärpathologen überprüft, der vom American College of Veterinary Pathologists (SEK) zertifiziert wurde, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
Introduction
Obwohl es sich um einen hochkomplexen und ineffizienten Prozess1 handelt, trägt die Metastasierung wesentlich zur Morbidität und Mortalität von Krebspatienten bei2. Tatsächlich werden die meisten krebsbedingten Todesfälle auf die metastasierende Ausbreitung der Krankheit zurückgeführt3,4. Damit Tumorzellen erfolgreich metastasieren können, müssen sie sich von der primären Stelle lösen, durch angrenzendes Stroma eindringen, in den Blutkreislauf oder die Lymphgefäße intravasieren, zum Kapillarbett einer sekundären Stelle wandern, in das Sekundärgewebe extravasieren und sich vermehren oder wachsen, um metastasierende Läsionen zu bilden5. Die Verwendung von Mausmodellen war entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für metastatische Aussaat und Wachstum verantwortlich sind6,7. Dabei konzentrieren wir uns auf die Metastasierung von Brustkrebs, für die häufig sowohl gentechnisch veränderte Mausmodelle als auch Transplantationsmethoden eingesetzt werden – jede mit ihren eigenen Vorteilen und Einschränkungen.
Gentechnisch veränderte Brusttumormodelle nutzen brustdrüsenspezifische Promotoren, einschließlich MMTV-LTR (Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat) und WAP (Whey Acidic Protein), um die Expression von Transgenen im Brustepithel zu steuern8. Onkogene einschließlich Polyom mittleres T-Antigen (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 und Affenvirus 40 (SV40) wurden auf diese Weise exprimiert9,10, 11, 12, 13, und während diese genetischen Modelle für die Untersuchung der Primärtumorinitiation und -progression nützlich sind, metastasieren nur wenige leicht in entfernte Organe. Darüber hinaus sind diese genetischen Mausmodelle oft zeit- und kostenintensiver als spontane oder experimentelle Metastasierungsmodelle. Angesichts der Beschränkung der meisten gentechnisch veränderten Brusttumormodelle auf die Untersuchung von Metastasen sind Transplantationstechniken zu attraktiven Methoden geworden, um diesen komplexen Prozess zu untersuchen. Dazu gehören orthotope, Schwanzvenen-, intrakardiale und intrakranielle Injektion geeigneter Zelllinien.
Obwohl mehrere Brustkrebszelllinien nach orthotopischer Injektion in das Brustfettpolster leicht metastasieren14,15, kann die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der metastasierenden Tumorbelastung eine Herausforderung darstellen, und die Dauer solcher Studien kann in der Größenordnung von mehreren Monaten liegen. Insbesondere zur Beurteilung der Lungenmetastasierung ist die intravenöse Injektion in die Schwanzvene oft eine reproduzierbarere und zeiteffektivere Methode, wobei die metastatische Ausbreitung typischerweise innerhalb weniger Wochen auftritt. Da das intravenöse Injektionsmodell jedoch die ersten Schritte der metastatischen Kaskade umgeht, ist bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Studien Vorsicht geboten. In dieser Demonstration zeigen wir die Schwanzveneninjektion von Brusttumorzellen zusammen mit einer genauen und umfassenden Analysemethode.
Obwohl die Forschungsgemeinschaft erhebliche Fortschritte beim Verständnis des komplexen Prozesses der Brustkrebsmetastasierung gemacht hat, wird geschätzt, dass derzeit über 150.000 Frauen an metastasierendem Brustkrebs leiden16. Von den Patienten mit Brustkrebs im Stadium IV haben >36% der Patientinnen Lungenmetastasen17; Das ortsspezifische Muster und die Inzidenz von Metastasen können jedoch je nach molekularem Subtyp variieren18,19,20,21. Patientinnen mit Brustkrebs-assoziierten Lungenmetastasen haben ein medianes Überleben von nur 21 Monaten, was die Notwendigkeit unterstreicht, wirksame Behandlungen und neuartige Biomarker für diese Krankheit zu identifizieren17. Die Verwendung experimenteller Metastasierungsmodelle, einschließlich der intravenösen Injektion von Tumorzellen, wird unser Wissen über diese wichtige klinische Herausforderung weiter voranbringen. In Kombination mit der digitalen Bildgebungspathologie und der in diesem Protokoll beschriebenen Methode der metastasierenden Lungentumorlastanalyse sind Schwanzveneninjektionen ein wertvolles Werkzeug für die Brustkrebsmetastasenforschung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da die Forscher weiterhin die intravenöse Injektion von Tumorzellen als experimentelles Modell für die Metastasierung verwenden, fehlen Standardpraktiken zur Analyse der resultierenden metastasierenden Tumorbelastung. In einigen Fällen können signifikante Unterschiede in der metastasierenden Tumorbelastung bei Manipulation bestimmter Zelllinien und/oder Verwendung chemischer Verbindungen makroskopisch beobachtet werden. In anderen Fällen können jedoch subtile Unterschiede in der metastatischen Aussaat und im Wachst…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Repräsentative Daten wurden durch das National Cancer Institute (K22CA218549 bis S.T.S) finanziert. Zusätzlich zu ihrer Unterstützung bei der Entwicklung der umfassenden Analysemethode, über die hier berichtet wird, danken wir dem Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktorin – Krista La Perle, DVM, PhD) für Histologie und Immunhistochemie und dem Pathology Imaging Core für die Entwicklung und Analyse von Algorithmen.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
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