Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola
Summary
La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.
Abstract
La metástasis, la principal causa de morbilidad y mortalidad para la mayoría de los pacientes con cáncer, puede ser difícil de modelar preclínicamente en ratones. Pocos modelos de metástasis espontáneas están disponibles. Por lo tanto, el modelo experimental de metástasis que implica la inyección de la vena de la cola de líneas celulares adecuadas es un pilar de la investigación de metástasis. Cuando las células cancerosas se inyectan en la vena de la cola lateral, el pulmón es su sitio preferido de colonización. Una limitación potencial de esta técnica es la cuantificación precisa de la carga tumoral pulmonar metastásica. Mientras que algunos investigadores cuentan macrometástasis de un tamaño predefinido y/o incluyen micrometástasis después de la seccionamiento del tejido, otros determinan el área de lesiones metastásicas en relación con el área normal del tejido. Ambos métodos de cuantificación pueden ser extremadamente difíciles cuando la carga metastásica es alta. Aquí, demostramos un modelo de inyección intravenosa de metástasis pulmonar seguido de un método avanzado para cuantificar la carga tumoral metastásica utilizando un software de análisis de imágenes. Este proceso permite la investigación de múltiples parámetros de punto final, incluido el tamaño promedio de la metástasis, el número total de metástasis y el área total de metástasis, para proporcionar un análisis completo. Además, este método ha sido revisado por un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios (SEK) para garantizar la precisión.
Introduction
A pesar de ser un proceso altamente complejo e ineficiente1, la metástasis es un contribuyente significativo a la morbilidad y mortalidad de los pacientes con cáncer2. De hecho, la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se atribuyen a la propagación metastásica de la enfermedad3,4. Para que las células tumorales hagan metástasis con éxito, deben desprenderse del sitio primario, invadir a través del estroma contiguo, intravasar en la circulación sanguínea o linfática, viajar al lecho capilar de un sitio secundario, extravasar en el tejido secundario y proliferar o crecer para formar lesiones metastásicas5. El uso de modelos de ratón ha sido fundamental para avanzar en la comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la siembra y el crecimiento metastásico6,7. Aquí, nos centramos en la metástasis del cáncer de mama, para la cual a menudo se utilizan tanto modelos de ratón modificados genéticamente como métodos de trasplante, cada uno con su propio conjunto de ventajas y limitaciones.
Los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados hacen uso de promotores específicos de la glándula mamaria, incluyendo MMTV-LTR (repetición terminal larga del virus tumoral mamario de ratón) y WAP (Proteína ácida de suero de leche), para impulsar la expresión de transgenes en el epitelio mamario8. Los oncogenes que incluyen el antígeno T medio del polioma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 y el virus simio 40 (SV40) se han expresado de esta manera9,10,11,12,13, y aunque estos modelos genéticos son útiles para estudiar el inicio y la progresión del tumor primario, pocos hacen metástasis fácilmente en órganos distantes. Además, estos modelos genéticos de ratón son a menudo más prohibitivos en tiempo y costo que los modelos de metástasis espontáneas o experimentales. Dada la limitación de la mayoría de los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados para estudiar la metástasis, las técnicas de trasplante se han convertido en métodos atractivos para estudiar este complejo proceso. Esto incluye la inyección ortotópica, de la vena de la cola, intracardíaca e intracraneal de líneas celulares adecuadas.
Aunque varias líneas celulares de cáncer de mama hacen metástasis fácilmente después de la inyección ortotópica en la almohadilla de grasa mamaria14,15, la consistencia y reproducibilidad de la carga tumoral metastásica puede ser un desafío, y la duración de dichos estudios puede ser del orden de varios meses. Para evaluar la metástasis pulmonar, en particular, la inyección intravenosa en la vena de la cola es a menudo un método más reproducible y efectivo en el tiempo con diseminación metastásica que generalmente ocurre en el lapso de unas pocas semanas. Sin embargo, dado que el modelo de inyección intravenosa omite los pasos iniciales de la cascada metastásica, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de estos estudios. En esta demostración, mostramos la inyección de células tumorales mamarias en la vena de la cola junto con un método de análisis preciso y completo.
A pesar de que la comunidad investigadora ha logrado avances significativos en la comprensión del complejo proceso de la metástasis del cáncer de mama, se estima que más de 150.000 mujeres tienen actualmente cáncer de mama metastásico16. De las pacientes con cáncer de mama en estadio IV, >36% de las pacientes presentan metástasis pulmonar17; sin embargo, el patrón específico del sitio y la incidencia de metástasis pueden variar según el subtipo molecular18,19,20,21. Las pacientes con metástasis pulmonares asociadas al cáncer de mama tienen una mediana de supervivencia de solo 21 meses, lo que pone de manifiesto la necesidad de identificar tratamientos efectivos y nuevos biomarcadores para esta enfermedad17. El uso de modelos experimentales de metástasis, incluida la inyección intravenosa de células tumorales, continuará avanzando en nuestro conocimiento de este importante desafío clínico. Cuando se combinan con la patología de imágenes digitales y el método de análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica descrito en este protocolo, las inyecciones de la vena de la cola son una herramienta valiosa para la investigación de metástasis del cáncer de mama.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medida que los investigadores continúan utilizando la inyección intravenosa de células tumorales como modelo experimental para la metástasis, faltan prácticas estándar para analizar la carga tumoral metastásica resultante. En algunos casos, se pueden observar diferencias significativas en la carga tumoral metastásica tras la manipulación de líneas celulares particulares y/o el uso de compuestos químicos por vía macroscópica. Sin embargo, en otros casos, las diferencias sutiles en la siembra y el crecimient…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los datos representativos se financiaron a través del Instituto Nacional del Cáncer (K22CA218549 a S.T.S). Además de su asistencia en el desarrollo del método de análisis integral que se informa en este documento, agradecemos a The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) por los servicios de histología e inmunohistoquímica y al Pathology Imaging Core por el desarrollo y análisis de algoritmos.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
Referências
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Pesquisa do Câncer. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
