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Summary
ここで説明するプロトコルは、異なる大栄養素の質の食事にさらされた ショウジョウバエメラノガスター 幼虫によって定義された間隔内に食べられる食物の量の着色定量を可能にするプロトコルである。これらのアッセイは、神経細胞の熱遺伝学的スクリーンの文脈で行われる。
Abstract
飼育と摂食行動は、動物が発達、健康、フィットネスに不可欠なエネルギーと栄養素の源にアクセスすることを可能にします。これらの行動の神経調節を調査することは、栄養恒常性の基礎となる生理学的および分子的メカニズムの理解に不可欠である。このようなワーム、ハエ、魚などの遺伝的に難しい動物モデルの使用は、研究のこれらのタイプを大幅に容易にします。過去10年間、フルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、摂食行動と採餌行動の神経制御を調査する神経生物学者によって強力な動物モデルとして使用されてきました。間違いなく貴重ですが、ほとんどの研究は大人のハエを調べます。ここでは、幼虫がタンパク質と炭水化物の含有量が異なる食事にさらされたときに摂食行動を制御する神経基質を調査するために、より単純な幼虫神経系を利用するプロトコルについて説明する。我々の方法は、神経細胞の熱遺伝学的活性化スクリーンの文脈で行われる定量的な無選択供給アッセイに基づいている。読み出しとして、1時間間隔で幼虫が食べる食物の量は、タンパク質と炭水化物(P:C)比が異なる3つの染料標識食餌の1つにさらされるときに使用された。このプロトコルの有効性は、幼虫ショウジョウバエの神経遺伝学的スクリーンの文脈で、異なる大栄養素の質の食事で食べられる食物の量を調節する候補神経集団を同定することによって実証される。また、試験した遺伝子型を分類して分類して、その遺伝子型を分類して分類することができました。文献で現在利用可能な方法の簡単なレビューに加えて、これらの方法の利点と限界が議論され、また、このプロトコルが他の特定の実験にどのように適応されるかについてのいくつかの提案が提供される。
Introduction
すべての動物は、生存、成長、および生殖に必要な量の栄養素を獲得するためにバランスのとれた食事に依存しています1.食べるものの選択は、満腹レベルのような動物の内部状態に関連する多数の相互作用要因と、食品品質2、3、4、5などの環境条件の影響を受ける。タンパク質と炭水化物は2つの主要な栄養素であり、そのバランスのとれた摂取量は動物の生理学的プロセスを維持するために不可欠です。したがって、摂食行動を制御し、これらの大栄養素のバランスのとれた摂取量を維持する神経機構の理解は非常に重要である。これは、寿命、胎児性、代謝の健康などの生命史の形質は、タンパク質摂取摂取量6、7、8、9、10のレベルによって直接影響を受けるからです。
哺乳類を含む複雑な動物との進化的に保存された摂食習慣を示すより単純でより難易な生物の使用は、この種の研究に不可欠である。重要なことに、これらの単純な動物モデルは、高価で倫理的かつ技術的により効果的な文脈で複雑な生物学的質問を解剖する良い機会を提供します。過去数十年の間に、 ショウジョウバエは、その強力な遺伝的ツールキット、複雑でステレオタイプな行動、哺乳類との末梢および栄養センシング機構の保存されたアーキテクチャを有し、行動神経生物学者11のための実りあるモデルとなっている。最終的には、より単純な神経系を持つこの動物の食物摂取量がどのように調節されているかを理解することで、人間の摂食障害の根底にある神経機能不全を解き始めることができると期待しています。
摂食行動のための神経基質の研究は、動物の食物摂取量を同時に測定しながら、その神経活動を操作できることに深く依存している。摂取される食品の量が最小限であるため、ハエが食べる食品の量を定量することは非常に困難であり、現在利用可能なすべての方法は重要な制限を提示します。従って、ゴールドスタンダードは、相補的方法論12の組み合わせを使用する。成虫ハエは歴史的に遺伝的および行動モデルとして支持されてきた。それにもかかわらず、ショウジョウバエ幼虫は、摂食行動をコードする神経基質を調査する機会も提供する。約12,000個のニューロンを持つ幼虫中枢神経系(CNS)は、約150,000個のニューロンを含む成人のそれよりも有意に複雑ではありません。幼虫の挙動は、より単純な機関車機能と感覚システムに依存しているため、この低い複雑さは数値だけでなく機能的でもあります。彼らの神経系の明らかな単純さにもかかわらず、幼虫はまだ完全な摂食行動を示し、ショウジョウバエの幼虫における食物摂取を定量化するいくつかの方法は5、13、14、15に記載されている。神経活動の操作と組み合わせることで、ショウジョウバエの幼虫は食物摂取の神経調節を理解するための非常に難解なモデルを構成することができる。
ここでは、異なる栄養素の質の食事にさらされた幼虫の食物摂取量を定量化するための詳細なプロトコルが提供されています。食事、いわゆるマクロ栄養素バランス食は、タンパク質および炭水化物の内容が異なり、特にタンパク質対炭水化物(P:C)比:1:1(タンパク質豊富な食事)、1:4(中間食)、および1:16(タンパク質貧しい食事)を 図1Aに示した。簡単に言えば、青色食品染料を染めたこれら3つのイソカロリックスクロース酵母(SY)ベースの食事を用いて定量的な無選択給餌アッセイを確立した。酵母エキスとショ糖はタンパク質と炭水化物源として使用され、両方とも炭水化物を含むため、P:C比の変動は、上記の16 と 図1Bに示すように、これら2つの成分のバランスを変化させることによって得られた。主な実験手順を示すプロトコルの概略図を 図 2に示します。
このプロトコルは、異なるP:C比の食事における幼虫摂食レベルの調節および熱遺伝学的神経細胞の文脈における特定の神経集団の役割を調査することを目的として設立された。過渡受容体ポテンシャル(TRP)ファミリーからよく特徴付けられた神経遺伝学的ツールを使用しました:ショウジョウバエ過渡受容体電位チャネル (dTRPA1), 温度と電圧ゲートカチオンチャネルであります, 周囲温度が25 °C17を超えて上昇したときに作用電位の発射を可能にします.dTRPA1トランスジーンを表現するために、我々はジャネリア研究キャンパス18、19でFlyLightプロジェクトの文脈で、ルービン研究所に設立されたショウジョウバエゲノムからのシス-調節領域に基づくGal4ラインを利用しました。
プロトコルは、ここで説明する、活性化画面のコンテキストで確立されているが、実験者が他の特定のニーズまたは興味に容易に適応させることができる、すなわち温度感受性神経サイレンサーShibireTS20を用いて抑制画面を実行し、dTRPA1に代わるものである。この他の適応については、プロトコルとディスカッションのセクションで説明します。
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Protocol
1. スクロース酵母(SY)ダイエットの準備
- すべての乾燥成分(寒天、酵母、スクロース)の重さを量り、栄養素バランスとL3飼育食餌を摂取します。1 Lの食品を調製するために必要な各成分のグラムの量を 図1Bに示します。
注:60mmペトリ皿を満たすには約13mLの食品が必要であることを考慮してください。 - すべての成分を滅菌蒸留水に溶かし(食品の準備に必要な水量の約50%を使用)、培地を5〜10分間かき混ぜます。
- 50分間オートクレーブ。
- 培地を冷やした後、ニパチンとプロピオン酸溶液を食事に加え、それぞれ3%と0.3%の最終濃度(v/v)で添加する。栄養素バランスダイエットに、青い食品染料を1%の最終濃度(v/v)に加えます。蒸留水で総量を完了します。
- 慎重に60ミリメートルペトリ皿に食餌を注ぎ、注いだ食品の量は、プレートのそれぞれでほぼ同じになるように。食事のP:C比でプレートにラベルを付けます。
注:摂食アッセイの日に栄養バランスの栄養を整えます。不可能な場合は、4°Cで、密閉容器に、最大3日間保存してください。より長い貯蔵期間は、あまりにも乾燥して硬い食事をレンダリングし、幼虫は媒体に穴を掘ることができません。
2. ペアレンタルラインの遺伝的十字架
注:遺伝的十字を設定するには、Gal4/UASシステム21を使用してください。このプロトコルでは、特定の神経集団における神経機能を活性化するために、UAS dTRPA1線17の女性処女が使用され、ジャネリアGal4線から男性に交配した(図2A)。使用される遺伝的制御は、DTRPA1線と「空のGAL4」ラインとの間の十字架の子孫であり、Rubin Gal4コレクションを生成するために使用されるベクターにGal4を運ぶが、規制断片は存在しない(attP2)22。神経抑制を促進するために、DTRPA1の代わりにシビレツ20をコードするUASラインを使用することができる。
- L3飼育ダイエットプレート付き60mm胚コレクションケージを設定し、アクティブな酵母ペーストを補います。
- 成人UAS dTRPA1女性処女とジャネリアGal4男性(5〜8歳)を胚採取ケージに移し、湿度60%、明暗サイクル12:12で25°Cで24-48時間の交配を可能にする(図2A)。60 mm胚コレクションケージの場合、1クロスあたり約100匹の処女メスと30人の男性を使用します。
- 交配期間の終わりに、遺伝的十字架に使用されるL3飼育ダイエットプレートを取り除き、捨てます。卵の産卵と幼虫のステージングを実行するために、新鮮なL3飼育ダイエットプレートに置き換えます。
3. 第3インスター幼虫(L3)の準備
- 交配した成体ハエを新鮮なL3飼育ダイエットプレートに移し、25°Cで3〜4時間産卵を可能にする(図2B)。すべてのプレートが遺伝子型、P:Cの食事と卵の産卵日の比率でラベル付けされていることを確認してください。
注:時間を節約するために、卵の余分な取り扱いを避けるL3飼育食に直接産卵を行います。小規模な遺伝子スクリーニングの場合、リンゴジュース寒天プレートを用いて産卵の最適化が得られる。 - 産卵期間の終わりに、ケージからプレートを取り出し、プラスチック製の蓋で覆います。酵母エキスを使用してL3の飼育プレートを補う場合は、産卵の終わりに残った酵母をすべて取り除くようにしてください。これは幼虫の成長の間に不一様な供給を避けるために重要である。
注:交配された成人は新鮮なL3飼育ダイエットプレートに移すことができるので、より多くの卵の産卵が行われ、より実験的な幼虫が得られる。連続した卵子は、1週間の間に同じ成人と一緒に行うことができます。 - 1プレート当たりの卵の数を推定し、幼虫密度をプレートあたり最大200個の胚に保ちます。この推定は、プレートの4分の1の胚数を数えることによって行うことができる。
注:過密プレートは幼虫の発達を遅らせ、幼虫の摂食行動に影響を与えます。 - L3飼育プレートを18°C(許容温度)、湿度60%、12:12の明暗サイクルでインキュベートし、幼虫が9日間成長することを可能にする(図2B)。
- 産卵(AEL)後の9日目に、試験する遺伝子型(および複製のために)のそれぞれから10 L3の3つのグループを収集する。さらに、「ゼロ染料食品」コントロールのために10 L3のグループを収集します。幼虫の採取は、卵の産卵を行うために使用される1日の同等の期間に行われることを確認してください(例えば、産卵が午前10時から午後2時の間に発生した場合は、同じ期間に9日間AELの間に幼虫を収集する)、できるだけ穏やかに、鉗子#5またはフェザーウェイト鉗子を使用して行われます。次のステップ(3.6)で示されるように、幼虫を直接移送します。
注:「ゼロ染料食品」コントロール動物は、摂食アッセイでは青色染料なしで食べ物を与えられる幼虫です。このコントロールは、幼虫抽出物の背景吸光度を除去するために不可欠です。 - 採取した実験幼虫を1mLの水を含むプラスチック製の皿重量ボートに移します。 図 3に示す指示に従って、L2 ではなく L3 が収集されていることを確認します。
注:水または1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むプラスチックボートへのL3のコレクションは、授乳アッセイの開始前に幼虫を十分に水分補給し続けることが重要です。これは、異なる遺伝子型から複数の実験的なL3基が同時に収集されている場合に特に重要です。各グループの収集順序を追跡するので、各グループの食糧不足の期間の違いは最小限に抑えられます。このステップでのプラスチックボートの使用は幼虫が水浴に直接浮かぶようにする任意ステップ4.3を促進する。
4. 熱遺伝学的活性化と無選択給餌アッセイ
注:概日リズムに関連する可能性のある変動を最小限に抑えるために、1日とほぼ同じ時間に給餌アッセイを実行することをお勧めします。また、常に制御実験(UAS dTRPA1と「ゼロ染料食品」幼虫に交差した「空のGal4」ラインの子孫)を、目的の遺伝子型と並行して実行します。
- インキュベーターを30°C(非許容温度)に設定し、高湿度(少なくとも65%)を維持するアッセイ中の幼虫脱水を避けるために。
- 給餌アッセイを開始する前に、30°Cで30分間温めてアッセイプレートの温度を平衡化します。
- (オプション)実験幼虫を37°Cの水浴で2分間熱ショックを受けた。いくつかの水を含むプラスチック重量船の動物とこのステップを実行します。
注:このステップの目的は、摂食アッセイの開始以来、ニューロンの発火を促進することによってニューロン活性化を強化することである。 - 複数のタイマーを1時間の準備をしてください。使用されるタイマーの数は、試験対象の実験グループの数と、幼虫の取り扱いに関する実験者の熟練度に依存します。
注: 複数のタイマーを使用することは、すべての遺伝子型に対してアッセイの持続時間を一定に保つために重要です。 - プラスチックボートから水を慎重に排出し、湿らせた柔らかいブラシを使用して、L3グループをボートからアッセイプレートの中央に静かに移します。プレートの蓋を戻し、正確な1時間の給餌セッションを維持するために、各プレート(またはプレートのグループ)のタイマーを開始します。
- 幼虫が暗い中で30°Cで1時間餌を与えるようにします(図2C)。
注:暗闇の中でのアッセイのパフォーマンスは、食事が同じ染料濃度を含んでいるにもかかわらず、トーンが異なるように、食事全体の視覚的な手がかりの違いを制御するために重要です。 - プレートを氷浴に移して、給餌アッセイを停止します。氷を可能な限り押し下げて、プレートに安定した表面を提供します。
注:低温は、穴あけや掘削行動を阻害することによって、供給の終わりを促進します。幼虫のほとんどは、数分後に食品プレートを表面化し、次の手順で回復を促進します。
5. 食品染料抽出
- テストした10個のL3の各グループに2mLマイクロチューブを用意し、ほぼ同量の0.5mmガラスビーズ(マイクロチューブの底部を満たすのに十分)と300 μLの氷冷メタノールを含みます。ベンチクーラーを使用して、マイクロチューブを冷たく保ちます。
注意:メタノールは非常に可燃性と毒性があります。換気の良い場所で作業し、ニトリル手袋を着用するなど、この試薬の取り扱いに推奨されるすべての安全手順に従ってください。
注:メタノールの使用は、幼虫のサンプルを固定し、キューティクルのメラニン反応を避けるために重要です。 - #5またはフェザー級鉗子を使用して、10 L3のグループを送り込みアッセイプレートから慎重に回収し、水を含むアッセイプレートの蓋に移します。幼虫をすすいで体の破片を取り除き、幼虫を優しく取り扱い、怪我をしないようにします。各遺伝子型の回収された幼虫の数を複製ごとに記録し、幼虫1回当たりの平均食物摂取量を定量化できるようにします。
注:負傷した幼虫は、色分け定量には適さないため、キューティクルをメラナイズするので廃棄する必要があります。 - L3グループを5.1で用意した2mLマイクロチューブに移します。
- 幼虫組織をリセ化し、ステップ5.1で添加した組織ライザーとガラスビーズを用いた機械的なライシス法により、腸から食品染料を抽出する。(組織ライザーが利用できない場合は、均質化害虫を使用してください)。優先的に、このステップは4°C(図2D)で行います。
注: この手順の所要時間は、使用する機器によって異なります。従来の組織ライザーを用いて、1分分抽出で十分である。時間の制限の場合、プロトコルは、このステップの最後に一時停止し、後で続行することができます。サンプルは-20°Cで保存してください。 - 抽出物を 1.5 mL マイクロチューブを洗浄し、2 mL マイクロチューブを新しい 1.5 mL マイクロチューブに直接反転します。穏やかに行われる場合、ガラスビーズのほとんどは2 mLマイクロチューブの底に留まるでしょう。
- 抽出物を遠心分離して細胞の破片を取り除き、最大速度で10分間、4°Cで。
- 上清を集めて1.5 mLマイクロチューブを洗浄します。上清に細胞の破片がまだ見える場合は、ステップ 5.6 と 5.7 を繰り返します。
6. 食品消費の色分け定量
- 標準溶液を調製し、較正曲線を生成し、開始青色色素溶液のメタノールでシリアル1:2希釈を行う。ブランクとして、メタノールのみを使用してください。基準の濃度は、動物の食物摂取量のレベルに依存します。
注:ここで提示したパイロット画面の場合、幼虫抽出物に対して得られた色素濃度が0.02~1.93μL/mLの範囲であったため、メタノール中の2μL/mLブルー色素溶液の8連続希釈度の吸光度を測定した標準曲線を用いた。必要に応じて、実験試料の色素濃度に応じて、これらの溶液の濃度を増減する。 - 実験サンプル(ステップ5.7で得られた)の100μLを、標準およびブランク(ステップ6.1)を96ウェルマイクロプレートのウェルに移し、プレートリーダーを用いて600nmで吸光度を測定する(図2E)。背景吸光度を取り除くために、幼虫抽出物の「ゼロ」として青染めなしで食品に供給された幼虫から得られた抽出物の吸光度を測定する(「ゼロ染料食品制御」)。
- 標準曲線を生成し、各実験幼虫群から得られた吸光度値を、食物摂取量(mLの体積)と相関させる。ステップ5.2で各群に集められた幼虫の数を考慮に入れて、幼虫1人当たりの平均食物消費量を見つける
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Representative Results
ショウジョウバエ幼虫は、過剰な炭水化物23を摂取する費用でタンパク質の摂取量を調節する(図2Eの概略図)。実際には、このタンパク質摂取の優先順位付けは、他の多くの動物で観察されており、タンパク質利用24,25と呼ばれています。
この堅牢な摂食行動応答を利用して、行動ベースのスクリーンは、マクロ栄養素バランスに関与する神経集団を同定することを目的として設計された。選択なしの摂食アッセイが確立され、L3(1グループあたり10個)のグループがdTRPA1を使用して1時間、ニューロン熱遺伝学的活性化条件下で、特定のP:C比(1:1、1:4および1:16)を含む3つのイソカロリック(248 Cal/L)食品染色食でアドリビタムを供給することを可能にする(図1および図1C)を樹立した。読み出しとして、異なるP:C比の大栄養素食で食べられる食品の平均量が使用された。Gal4/UASシステム21を利用し、FlyLightプロジェクト18、19のJanelia Gal4ラインの一部を利用して、dTRPA1の発現は特定の神経集団において誘導された。
このプロトコルに記載されている方法により、幼虫神経系における特定の神経集団の熱遺伝学的活性化の下で、P:C比の観点から、消費されるマクロ栄養素の相対的な量を定量化することができました。この実験的アプローチは、ニューロンの異なる集団を活性化することが、第3インスター幼虫におけるマクロ栄養素のバランスに大きな影響を与える(図4、表1)。コントロールライン(attP2)について観察された摂食パターン(attP2)は、より低いP:C比ダイエットで試験した幼虫による食物摂取量の期待される代償的増加を示すことによって、この方法の有効性を示す(図4の灰色の点と線)。さらに、遺伝子型と食事との間に有意な相互作用が見られ、これは、特定の神経集団の熱遺伝学的活性化が、幼虫が食事の栄養素の質に応じて食物摂取量を調節する方法を変えることを意味する。
3つの大栄養素バランス食でテストした遺伝子型の摂食パターン(1:1,1:4,1:1:16)は 、図4 の色付きの点線と線で示され、統計分析は 表1に入手可能である。
活性化画面では、合計で、幼虫神経系でまばらに発現することが知られている36のジャネリアGal4ラインがテストされた。線形回帰モデルを用いて、遺伝的制御動物を参照して、どの遺伝子型が有意に異なる食物摂取量を示すかを決定した。これらの違いには、すべての食事で食べられる食物の絶対量の違い、または栄養素バランス応答の違い(食事の異なるP:C比に対する応答の傾き)が含まれていました。
3つの食事すべてで、R12E06は対照動物よりも有意に多くの食物を食べた。また、中級食と低タンパク質食に対する食物摂取量の増加を過剰に補償し、食事の摂取とP:C比の間の相互作用項の有意な差によって示されるように(表1)。R22H01はコントロールよりも有意に多く食べたが、マクロ栄養バランス応答で異ならなかった(表1)。R14B11、R19G11、R21B06、R29C02およびR48F09幼虫は、少量の食物を摂取し、利用可能な食事の栄養質の悪さを補う能力を失った(食物摂取量とP:C比の有意な相互作用条件によって示されるように、 表1)。最後に、R45D11幼虫は、中級食とタンパク質貧しい食事(1:4と1:16)よりも1:1のP:C比を含むタンパク質が豊富な食事で有意に多く食べ、これは低タンパク質ダイエットで期待されるものとは正反対です。
そこで、我々の方法により、実験用幼虫を各遺伝子型から、食べられる食物の総量に関連する表現型クラスに分類し、低P:C比の食事を過剰に摂取してタンパク質摂取を優先する能力を持つ。実験動物のために5つのフェロチクラスが確立されました(図5):1-「多くを食べる」(コントロール動物よりも多く)、タンパク質希釈を過剰に補います。2 – "たくさん食べるが、正常に補償";3 – "少し(コントロールよりも少ない)を食べるが、補償";4 – "少し食べて、補償しない";5 – "異常に食べる" (タンパク質が豊富で中間食の多くタンパク質貧しい食事よりも).さらに、これらの型分類クラスと遺伝子型のそれぞれについて、我々は第三のインスター幼虫の中枢神経系におけるGFPパターンを示す。この情報は、FlyLight Project オンライン プラットフォームで一般に公開されているイメージング データから取得され、1 つは、関心のあるすべてのルービン Gal4 行の式パターンにアクセスできます。
図1:当社のプロトコルで使用されるスクロース酵母(SY)ダイエット。(A)青い点は、摂食アッセイで使用される等カロリック(248カロリー/L)の栄養素バランス食を表し、タンパク質と炭水化物(P:C)比が異なります:1、1:4、1:16。ベージュのドットは、P:C比1:2と495カロリー/Lのカロリー密度(B)スクロース酵母(SY)ベースの食事の詳細な組成および栄養情報を含む実験的な第3インスター幼虫(L3)を飼育するために使用される食事を表します。寒天、スクロース、酵母:成分はすべての食事のために同じです。1 Lの食事を調製するために必要な成分のグラムの量が示されている。青い色素の1%(v/v)をマクロ栄養バランス食に加え、L3飼育食にニパガーンおよびプロピオン酸溶液をそれぞれ3%および0.3%の最終濃度(v/v)に加えなければならないことに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Gal4/UASシステムを利用した私たちのプロトコル(A)ペアレンタルラインの遺伝的クロスに関与する主なステップの概略表現。DTRPA1をコードするルービンGal4線とUAS線との間の十字は、幼虫中枢神経系における特定の神経集団の熱遺伝学的活性化を可能にする。(B)実験用第3インスター幼虫(L3)の調製。親の雌は3〜4時間産卵を許し、幼虫のステージングは9日間の寛容温度(18°C)で起こる。任意は、給餌アッセイの前に2分間の37°Cでの熱ショックです。(C)非寛容温度(30°C)で1時間の神経機能および無選択摂食アッセイの熱遺伝学的活性化。各遺伝子型から10個の実験L3の3つのグループを、炭水化物(P:C)比(1:1、1:4および1:16)に特異的なタンパク質を含む栄養素バランス食のそれぞれで供給を許可した。(D) 食品染料抽出。幼虫の機械的な液化は、組織ライザーを用いて、青色食品染料を抽出する。(E) 食品摂取定量化。幼虫抽出物中の食品染料濃度を定量することにより幼虫当たりの食べ物の平均量を定量する。実験試料の吸光度、標準および「ゼロ」を、96ウェルプレートリーダーを用いて600nm(青)で測定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 第2(L2)と第3の星の間の違いショ ウジョウバエ 幼虫(L3)。 L2とL3は、立体顕微鏡下での尖塔の観察により容易に区別することができる。L2の前尖はクラブに似ていますが、L3では分岐しています。他の特性は、2つの星を区別するのに役立ちますが、主観的で信頼性が低いです。L3の後部尖塔は、L2に欠けているか、弱く存在する先端に暗いオレンジ色のリングを持っています。L3幼虫では気管が厚い。イラストはマリサ・オリベイラ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:特定のタンパク質を含む3つの栄養素バランス食における神経細胞の熱遺伝学的活性化条件下での幼虫当たりの食物量(P:C)比。 1:1、1:4および1:16の特定のP:C比を含む3つの大栄養素バランス食における幼虫(mL)あたりの食べ物の量の平均レベル。10個の第3インスター幼虫の群は、各遺伝子型から、1時間の間に、ニューロンの熱遺伝学的活性化条件下で、dTRPA1を用いて、30°Cで供給させた。試験された遺伝子型(ルービンGal4線とUAS dTRPA1線の間の遺伝的十字架からの幼虫前生)は、異なる色の点と線で示される。遺伝的制御(灰色で示される)として、「空のGal4」ライン(attP2)とUAS dTRPA1の間の十字架からの幼虫子孫が使用された。凡例に示されている遺伝子型に与えられた名前は、使用される「ルービン GAL4」行に関連していました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:5つの主要な表述クラスでテストされた行をグループ化する。 数字で示されるフェノミカルクラスは、食べられる食物の総量とタンパク質摂取優先順位付け応答を維持する能力の点で観察されたフェノタイプの組み合わせに基づいていました:1 - 多く(対照動物よりも多く)を食べ、過食によってタンパク質希釈を補うことができました。2 – たくさん食べて、補償することができませんでした。3 - 少し(コントロールよりも少ない)を食べるが、補償。4 – ほとんど食べて、補償できませんでした。 そして5 - 幼虫が食事中のタンパク質含有量の大栄養素希釈に応答して期待どおりに振る舞わなかった「異常」と呼ばれる余分な表現型クラスは、タンパク質が豊富で中間食でタンパク質が豊富で中間食で食べる。各遺伝子型について、第3インスター幼虫の中枢神経系におけるGFP発現パターンが示されている。このアッセイで使用されるルービンGal4ラインのイメージングデータは、一般に公開されているFlyLightプロジェクトオンラインプラットフォーム26から抽出された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| アノバテーブル(タイプII検定) | |||||
| 応答: 濃度/L3 | |||||
| 合計平方メートル | Df | F 値 | Pr(>F) | ||
| 食べ物 | 0.086832 | 1 | 113.5358 | < 2.2e-16 | *** |
| 遺伝子型 | 0.078443 | 10 | 10.2567 | 9.762e-15 | *** |
| 食品 : ジェノタイプ | 0.064038 | 10 | 8.3733 | 6.416e-12 | *** |
| 残 差 | 0.215673 | 282 | |||
| 有意性コード: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 ''0.1 ' ' 1 | |||||
| サマリー表(以下の係数はattP制御遺伝子型と比較されます): | |||||
| 見積もる | Std. エラー | t 値 | Pr(>||) | ||
| (インターセプト) | 0.064245 | 0.004316 | 14.886 | < 2e-16 | *** |
| 食べ物 | -0.058117 | 0.007206 | -8.066 | 2.10e-14 | *** |
| 遺伝子型 R12E06 | 0.040243 | 0.008961 | 4.491 | 1.03e-05 | *** |
| 遺伝子型 R14B11 | -0.053347 | 0.014361 | -3.715 | 0.000245 | *** |
| 遺伝子型 R19G11 | -0.044880 | 0.010788 | -4.160 | 4.23e-05 | *** |
| 遺伝子型 R21B06 | -0.051912 | 0.009363 | -5.544 | 6.79e-08 | *** |
| 遺伝子型 R22H01 | 0.017682 | 0.007296 | 2.423 | 0.016004 | * |
| 遺伝子型 R29C02 | -0.043102 | 0.011113 | -3.879 | 0.000131 | *** |
| 遺伝子型 R40D06 | -0.005341 | 0.009876 | -0.541 | 0.589102 | |
| 遺伝子型 R45C03 | 0.004064 | 0.009876 | 0.412 | 0.680997 | |
| 遺伝子型 R45D11 | -0.052579 | 0.009876 | -5.324 | 2.08e-07 | *** |
| 遺伝子型 R48F09 | -0.044612 | 0.011362 | -3.926 | 0.000108 | *** |
| 食品 : ジェノタイプ R12E06 | -0.037763 | 0.015440 | -2.446 | 0.015067 | * |
| 食品 : ジェノタイプ R14B11 | 0.058054 | 0.027100 | 2.142 | 0.033031 | * |
| 食品 : ジェノタイプ R19G11 | 0.051532 | 0.017726 | 2.907 | 0.003937 | ** |
| 食品 : ジェノタイプ R21B06 | 0.054403 | 0.015689 | 3.467 | 0.000607 | *** |
| 食品 : ジェノタイプ R22H01 | -0.020863 | 0.012377 | -1.686 | 0.092979 | . |
| 食品 : ジェノタイプ R29C02 | 0.048996 | 0.018714 | 2.618 | 0.009317 | ** |
| 食品 : ジェノタイプ R40D06 | 0.003804 | 0.016550 | 0.230 | 0.818371 | |
| 食品 : ジェノタイプ R45C03 | 0.034117 | 0.016550 | 2.061 | 0.040177 | * |
| 食品 : ジェノタイプ R45D11 | 0.090661 | 0.016550 | 5.478 | 9.53e-08 | *** |
| 食品 : ジェノタイプ R48F09 | 0.051184 | 0.019045 | 2.688 | 0.007625 | ** |
| 有意性コード: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 ''0.1 ' ' 1 | |||||
| 残留標準誤差: 0.02765(自由度 282) | |||||
| 複数 R-2 乗: 0.516, 調整済み R-2 乗: 0.4799 | |||||
| F統計量:21と282 DFの14.31、p値:<2.2e-16 | |||||
表1:食物摂取量に及ぼす食事の神経細胞の熱遺伝学的活性化および栄養素の質の影響に関するANOVA表 対照動物とは大きく異なる摂食行動を示す遺伝子型を決定するために線形モデルを取り付けた。
| 遺伝子型 | 関連遺伝子 | 元 | BDSC ストック番号 |
| w [*] ;P{UAS-TrpA1(B)K}attP2 / TM6B、Tb[1] | ブルーミントン | 26264 | |
| w[1118] ;P{GAL4.1Uw}attP2 | ジャネリア | 68384 | |
| w[1118] ;P{GMR12E06-GAL4}attP2 | ネット (CG11450) | ジャネリア | NA |
| w[1118] ;P{GMR14B11-GAL4}attP2 / TM3、Sb[1] | dnc (CG32498) | ジャネリア | 49255 |
| w[1118] ;P{GMR19G11-GAL4}attP2 | CG33696 | ジャネリア | 48864 |
| w[1118] ;P{GMR21B06-GAL4}attP2 | oa2 (CG6919) | ジャネリア | 49857 |
| w[1118] ;P{GMR22H01-GAL4}attP2 | フル (CG14307) | ジャネリア | 49001 |
| w[1118] ;P{GMR29C02-GAL4}attP2 | Ptp69D (CG10975) | ジャネリア | 48088 |
| w[1118] ;P{GMR40D06-GAL4}attP2 | cnc (CG17894) | ジャネリア | 48616 |
| w[1118] ;P{GMR45C03-GAL4}attP2 | クニ (CG4717) | ジャネリア | 47936 |
| w[1118] ;P{GMR45D11-GAL4}attP2 | pnt (CG17077) | ジャネリア | 49563 |
| w[1118] ;P{GMR48F09-GAL4}attP2 | dpr8 (CG32600) | ジャネリア | 50377 |
表2:この研究で使用される ショウジョウバエ ライン。 使用されるすべての行の詳細情報:コード名、遺伝子型、関連遺伝子、起源およびブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC)番号。
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Discussion
このプロトコルを使用すると、異なるP:C組成の食事にさらされたときに、タンパク質と炭水化物の摂取量を調節する特定の神経集団の熱遺伝学的活性化の下で幼虫の能力をテストすることができます。この方法は、異なる栄養素の質の異なる食事全体の食物摂取量の制御に関連する神経集団を同定することを目的とした幼虫予備スクリーニングの文脈で試験された。この研究はまた、ショ ウジョウバエ 幼虫が栄養恒常性に関連する摂食行動のニューロン基礎を調査するための貴重な動物モデルであることを実証することに貢献する。
プロトコルでメモとして提供される情報に加えて、我々はいくつかの重要な側面をさらに議論したいと思います。他の行動アッセイと同様に、動物の行動に関連する変動を最小限に抑えるために、実験者が対策を講じる必要があります。心に留めておくべき非常に重要な側面は、発達的に同期した動物を得ることの重要性に関連しています。それらの発達段階で十分に同期している初期のL3幼虫の使用は、摂食アッセイ27の間に動物によって示される行動の変動を減少させる。幼虫の同期は、短い卵の産卵によって、そして培養中の幼虫の密度を制御することによって達成される。産卵期間は、プロトコル(3〜4時間)で示すものよりも長く使用しないでください。また、幼虫密度をプレート当たり最大200匹に制御することで、発達の遅れを回避し、摂食行動のさらなる変動を排除します。交尾後に最初の卵が産卵し、均質性を維持し、より良い同期幼虫の発達を得るために廃棄されなければならないことに注意してください。雌は卵子を卵性に受精させ、発達の段階を変えて産み、幼虫の採取の均一性を維持するのが難しい。最終的なコレクションの前に、少なくとも最初の1時間の卵の収集プレートを廃棄することが不可欠です。幼虫の取り扱い中に動物に引き起こされるストレスも行動に悪影響を及ぼす可能性があることを考慮してください。柔らかく水を湿らせたブラシを使って、できるだけやさしくしてください。最後に、大量のレプリケートにより、より信頼性の高いデータセットが生成されることを念頭に置いてください。
実験プロトコルと同様に、我々の方法はいくつかの制限を提示する。動物の腸内の食物染料の蓄積に基づいて食物摂取量を定量化する色分け法を使用するには、アッセイの持続時間に関連するいくつかの予防措置が必要です。成体ハエの場合、染料蓄積に対して定常状態に達する重大なリスクがあることを実証した。幼虫でこのようなことが起きているという証拠はありませんが、最大60分の給餌アッセイを行うことにしました。この期間は便利で、ハイスループット画面と互換性があります。また、プロトコルの全持続時間をできるだけ短くしておくと、セクション 4、5、6 のすべてのステップを 1 営業日で完了できます。摂食アッセイの持続時間を変更する必要がある場合、アッセイ期間が60~120分の範囲で、遺伝子型全体の食物摂取量を効率的に定量化できる必要がある。食物摂取法の感度は、少量の食物が消費される場合にも比較的低く、食物摂取量が非常に低い遺伝子型の分解能を大幅に低下させる。選択なしのパラダイムを用いて給餌アッセイを設定しました。幼虫の各実験グループには1つの食事タイプしかなく、動物はタンパク質や炭水化物の消費レベルを独自に調節することはできません。さらに、化学的に未定義の食事を使用するため、幼虫の摂食パターンに直接影響を与える可能性のある栄養素濃度の制御を維持することは困難です。これらの問題を克服するために、または予備的な画面で見つかったヒットを確認し、さらに解剖するために、実験者は、定義された合成(ホリディック)培地10 を使用して、前述の30のように食品選択アッセイを設定することによって、正確かつ制御された実験的栄養コンテキストを確立する可能性を検討したい。熱遺伝学的神経変調を伴うプロトコルを使用している間、必要な温度変化が動物の行動出力に直接影響を与える可能性があることを考慮することが重要です。光遺伝学的アプローチの補完的な使用は、温度誘発性偽陽性を制御することは興味深いだろうが、幼虫の摂食アッセイの文脈での光遺伝学の使用は、幼虫に食べ物の基質に埋め込まれた時間のほとんどを費やすので、技術的に困難である。
しかし、実験的アプローチのいくつかの強みを列挙することができます。我々の方法のシンプルさと比較的高いスループットは、異なる栄養条件にさらされたときにいくつかの遺伝子型の食物摂取量の定量を可能にする。幼虫期の摂食行動は、成体ハエよりも容易に定量化可能であり、より良い機能的読み出しの生成を可能にする。また、幼虫の自然環境に似た摂食アッセイを確立することは、以前に議論された31のように、大人よりも難しいことではありません。さらに、幼虫の摂食を定量化する他の確立された方法、すなわち一定期間の口のフック収縮数を手動でカウントしたものを32の時間に測定した場合、我々の比色法はより大きなスケールでの遺伝子スクリーニング研究を可能にする。いくつかの他の方法は、単に彼らの腸内の染色食品と幼虫の割合を採点することに基づいており、食物摂取量レベル33、34の正確な定量化を可能にしません。神経機能の神経遺伝学的制御に関しては、TRPA1トランスジーンが18°Cで不活性であるという事実は、神経活動が幼虫の発達を通じて影響を受けないことを保証する。これにより、実験的な神経細胞の活性化は、幼虫の発達中ではなく、摂食アッセイ中に排他的に行われることを保証します。さらに、我々のプロトコルは実験者の特定のニーズと利益に容易に適応することができることをもう一度言及したいと思います。例えば、神経機能の抑制は、活性化の代わりに、温度感受性神経サイレンサーShibireTS20をコードするUASラインに対してdTRPA1を置換することによって容易に得ることができる。また、実験幼虫が示す摂食レベルが非常に低い場合、食物摂取量を定量化することが困難になり、前に述べたとおり、摂食アッセイの前に30分の幼虫飢餓の追加ステップを行うことが可能である。この食糧剥奪ステップは、飢餓主導の行動のモジュレーターを調査している場合に特に興味深いことができます。最後に、以前の研究では、定量的な比色法を用いて、青染料で食品を標識することは、摂食12に影響を及ぼさないことが示された。それにもかかわらず、我々は、食品12の放射標識のような補完的で正確で敏感な方法の使用は、研究のより高度な段階で、予備的な段階で見つかったヒットの確認またはさらなる解剖を目指して、我々の方法の良好な補完となり、実験者によって考慮されるべきであると考える。これらすべての理由から、摂食行動をコードする神経回路の組み立てに関与する神経集団の同定を目的とした遺伝的スクリーン(特に一次スクリーン)を実行する方法の魅力を信じています。
最後の注意として、ジェネリアリサーチキャンパスに設立された何千もの幼虫Gal4ラインがブルーミントンショウジョウバエストックセンターで一般に公開されており、幼虫26 と成人19 CNS発現パターンに関する大量の情報がFlyLight画像データベース(http://www.janelia.org/gal4-gen1)でも一般に公開されているという事実に言及したいと思います。これらのリソースは、ショ ウジョウバエ 幼虫の摂食行動を調節するニューロンの推定構造機能ニューロンマップを精巧にすることを可能にする。これは、ニューロン画面で生成される表現型情報と使用されるドライバの発現パターンを統合することによって可能です。我々の方法は、 ショウジョウバエ 脳におけるマクロ栄養素バランスに関連する摂食行動のための予備的な神経細胞マップを生成するための有効なアプローチを構成すると考えている。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロトコルに記載されている実験装置の一部にアクセスを提供してくれたグルベンキアン・デ・シエンシア研究所(IGC)に感謝します。この研究は、ポルトガル科学技術財団(FCT)、LISBOA-01-0145-FEDER-007660によって支援されました。 PTDC/NEU- NMC/2459/2014,IF/00697/2014,ラカイシャHR17-00595をPMDに、オーストラリア研究評議会未来フェローシップ(FT170100259)からCKMへ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
| 96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, Portugal | ||
| Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
| Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
| Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
| Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
| Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
| Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
| Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30?C) |
| Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19?C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
| Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
| Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Nitrile gloves | VWR, USA | ||
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
| ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
| Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, Portugal | ||
| Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Timer | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ?C |
| Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |
References
- Raubenheimer, D. Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
- Carvahlo, M. J. a, Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective. Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).
- Steck, K., et al. Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila. Elife. 7, 31625 (2018).
- Itskov, P. M., Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Levine, M. E., et al. Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population. Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).
- Solon-Biet, S. M., et al. The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice. Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Jones, W. D. The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila. BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).
- Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target. Scientific Reports. 3, (2013).
- Schoofs, A., et al. Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain. PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).
- Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. Motor control of Drosophila courtship song. Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).
- Mirth, C. M. J. Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D.
- Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates. Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).
- Li, H. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).
- Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).
- Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).
- Almeida-Carvalho, M. J., et al. The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 13 2452-2475 (2017).
- Rodrigues, M. A., et al. Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time. Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L.
- Wu, Q., et al. Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system. Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster. Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).
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神経科学,課題 160 ショ ウジョウバエ,幼虫 熱遺伝学的神経細胞スクリーン 幼虫摂食行動 マクロ栄養バランス タンパク質 炭水化物 食物摂取測定 食品染料 着色定量Erratum
Formal Correction: Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/06/2020.
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An erratum was issued for: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae. A figure was updated.
Figure 1 was updated from:
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. Please click here to view a larger version of this figure.
