Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.
Abstract
Die hier vorgestellten Methoden demonstrieren Laborverfahren zur Dissektion von vier verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems (ZNS) von murinen Neugeborenen zur Isolierung glialer Subpopulationen. Der Zweck des Verfahrens besteht darin, Mikroglia, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) und Astrozyten aus kortikalem, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksgewebe zu dissoziieren, um weitere In-vitro-Analysen zu ermöglichen. Die ZNS-Region-Isolierungsverfahren ermöglichen die Bestimmung der regionalen Heterogenität zwischen Gliazellen in mehreren Zellkultursystemen. Es wird eine schnelle Isolierung der ZNS-Region durchgeführt, gefolgt von der mechanischen Entfernung von Hirnhäuten, um eine Meningealzellkontamination der Gliazellen zu verhindern. Dieses Protokoll kombiniert sanfte Gewebedissoziation und Beschichtung auf einer spezifizierten Matrix, die entwickelt wurde, um die Zellintegrität und -adhärenz zu erhalten. Die Isolierung gemischter Glia aus mehreren ZNS-Regionen bietet eine umfassende Analyse potenziell heterogener Gliazellen bei gleichzeitiger Maximierung der Verwendung einzelner Versuchstiere. Darüber hinaus werden gemischte Glia nach der Dissoziation von regionalem Gewebe weiter in mehrere Zelltypen unterteilt, darunter Mikroglia, OPCs und Astrozyten zur Verwendung in Einzelzelltypen, Zellkulturplatteneinsätzen oder Kokultursystemen. Insgesamt bieten die demonstrierten Techniken ein umfassendes Protokoll von breiter Anwendbarkeit für die sorgfältige Dissektion von vier einzelnen ZNS-Regionen von murinen Neugeborenen und umfassen Methoden zur Isolierung von drei einzelnen Gliazelltypen zur Untersuchung der regionalen Heterogenität in einer beliebigen Anzahl von In-vitro-Zellkultursystemen oder Assays.
Introduction
Glia sind notwendig für die richtige neuronale Funktion im ZNS. Sie bestehen aus drei Hauptsubpopulationen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die jeweils eine andere, aber unverzichtbare Rolle spielen1. Ohne die richtige Gliazelldiversität und -aktivität würde die neuronale Funktion stark beeinträchtigt, was zu einer Beeinträchtigung des ZNS führen würde. Glia sind in der Lage, die Neurotransmission zu beeinflussen, und jeder Zelltyp tut dies auf einzigartige Weise. Gliazellen im Gehirn haben die Fähigkeit, sowohl untereinander als auch mit neuronalen Zellen zu kommunizieren, um die richtige ZNS-Funktion zu erleichtern2. Oligodendrozyten erhöhen die Geschwindigkeit der elektrischen Übertragung durch die Bildung einer Myelinscheide, die die Clusterbildung von Ionenkanälen an den Knoten von Ranvier, den Orten der neuronalen Aktionspotentialerzeugung3, erleichtert. Mikroglia sind entscheidend für die Beschneidung von Synapsen, indem sie die synaptische Übertragung überwachen und neuronale Verbindungen nach Verletzungen "neu verdrahten"4. Darüber hinaus sind Mikroglia die am häufigsten vorkommenden residierenden Immunzellen des ZNS und fungieren als primäre Form der Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger5. Astrozyten können die synaptische Übertragung zwischen Neuronen regulieren, indem sie die Konzentration des extrazellulären Kaliumsverändern 6. Sie spielen auch eine Rolle bei der Kontrolle des lokalen Blutflusses7, der Freisetzung und Aufnahme neuromodulatorischer Elemente8 und spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke9. Daher ist jeder gliale Subtyp entscheidend für die ZNS-Funktion, da Defekte in jeder Art seit langem mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht werden, einschließlich psychiatrischer Erkrankungen, Epilepsie und neurodegenerativer Erkrankungen10.
Das größte Hindernis bei der Erforschung der ZNS-Pathobiologie ist die Unfähigkeit, menschliche Zellen im Kontext ihrer mikroökologischen Nische zu untersuchen. Menschliches Biopsiegewebe wird am häufigsten postmortal entnommen und Zellen können während der Extraktion und Verarbeitung leicht beschädigt werden oder verloren gehen. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, menschliche Zellen in vitro für längere Zeit am Leben und lebensfähig zu halten, ohne immortalisierte Zelllinien aus Tumoren abzuleiten, an denen sie ihre normalen physiologischen Eigenschaften nicht mehr genau widerspiegeln11,12. Darüber hinaus gibt es eine signifikante regionale Heterogenität zwischen den einzelnen Gliazelltypen13,14,15, und die Gewinnung regionaler ZNS-Proben von einzelnen Patienten ist nahezu unmöglich. Daher ist es notwendig, alternative Modelle zu entwickeln, um den Beitrag regionaler Glia bei spezifischen ZNS-Erkrankungen zu untersuchen.
Hier beschreiben wir ein in vitro System, das die regionsspezifische Isolierung mehrerer Gliasubpopulationen der Maus verwendet, was die Manipulation und Quantifizierung von Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs), aus denen reife Oligodendrozyten hervorgehen, und Astrozyten ermöglicht. Jede Population kann unabhängig voneinander isoliert und einer Vielzahl von experimentellen Techniken unterzogen werden, einschließlich Arzneimittel- oder Molekülbehandlung, Immunzytochemie, Protein- / RNA-Extraktion und -Analyse und anderen Kokultursystemen, je nach experimenteller Notwendigkeit. Darüber hinaus liefert diese Isolationstechnik eine hohe Zellzahl, die die Charakterisierung und Untersuchung jeder Gliapopulation im Hochdurchsatz ermöglicht. Es ermöglicht auch die Untersuchung der ZNS-Zelldifferenzierung, des Wachstums und der Proliferation als Reaktion auf eine Vielzahl von Mikroumweltreizen auf kontrollierte Weise, um Störfaktoren zu vermeiden, die typischerweise in einer In-vivo-Umgebung vorhanden sind. Schließlich erleichtert diese Zellisolierungstechnik die Manipulation von Gliazellpopulationen in verschiedenen ZNS-Regionen, um zu untersuchen, wie regionale Gliazellen miteinander interagieren und auf unterschiedliche Reize reagieren, was Präzision und Reproduzierbarkeit ermöglicht.
Protocol
HINWEIS: Alle Tierstudien wurden vom Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und genehmigt.
1. Bereiten Sie Medien und Vorräte für das Sezieren vor
HINWEIS: Alle Puffer- und Medienrezepte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Dieses Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einer als Biosicherheitswerkbank bezeichneten Gewebekultur durchgeführt.
- Bereiten Sie gemischte Gliamedien (MGM) vor und filtern Sie sie steril. Dies kann am Vortag erfolgen und bei 4 °C gelagert werden.
- Verdünnen Sie Fibronektin in einer Konzentration von 1:100 mit sterilemH2O. Das Volumen des verdünnten Fibronektins hängt von der Anzahl der Welpen und der ZNS-Region ab, die für das Experiment verwendet wurden. Verwenden Sie einen T25-Kolben für 1 Kortex, einen T25-Kolben für 2-4 Großhirn, einen T25-Kolben für 2-4 Hirnstängel und einen T25-Kolben für 2-4 Rückenmarks.
HINWEIS: Die Kombination von Gewebe aus derselben Region unter Verwendung der oben aufgeführten Kriterien ermöglicht eine angemessene Dissoziation, ohne das unten beschriebene Protokoll zu ändern. Die Kombination von mehr Gewebe als in Schritt 1.2 beschrieben erfordert eine weitere Optimierung der Dissoziationsreagenzienkonzentrationen. - 3 ml verdünntes Fibronektin in T25-Kolben bei Raumtemperatur pipettieren und 2 min einwirken lassen.
- Das Fibronektin absaugen und die Kolben über Nacht trocknen lassen, wobei der Kolbendeckel gelöst ist.
2. Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksdissektion
HINWEIS: Dieser Vorgang kann auf dem Tischgerät durchgeführt werden und erfordert einen Sezierbereich. Verwenden Sie strenge aseptische Technik für alle Schritte des Verfahrens und minimieren Sie die Exposition des Gewebes gegenüber der Raumluft. Bewahren Sie alle Medien während der Dissektion auf Eis gekühlt auf, um eine maximale Gewebekonservierung zu gewährleisten. Alternativ könnte dieses Verfahren in einer Haube durchgeführt werden, die die Verwendung eines internen Sezierbereichs ermöglicht.
- Wischen Sie alle Bereiche mit 70% Ethanol ab.
- 10 ml PBS/Antibiotikalösung (PAS) in eine 10 cm Petrischale pipettieren. Bereiten Sie eine Petrischale für jeden Welpen vor, der seziert werden soll. Auf Eis legen, um die Lösung gekühlt zu halten.
- In einer desinfizierten Gewebekulturhaube 9 ml DMEM (ohne Zusatzstoffe) in 4 separate 15-ml-konische Röhrchen pipettieren, eines für jede ZNS-Region, Schlauchkappen ersetzen und auf Eis legen. Platzieren Sie den Eiskübel mit Röhrchen in Reichweite des Sezierzielfernrohrs.
- Legen Sie die in Schritt 2.2 vorbereitete 10-cm-Petrischale auf die desinfizierte Dissektionsstufe.
- Betäuben und euthanasieren Sie Mäusewelpen gemäß dem institutionellen Protokoll und entfernen Sie den Kopf durch schnelle Enthauptung mit einer scharfen Schere.
HINWEIS: Postnatale Tag (P) 3-5 Welpen werden verwendet. Ältere Welpen haben ein stärker entwickeltes ZNS und sind möglicherweise keine ausreichende Quelle für expandierende Gliazellen. Jüngere Welpen (P) 0-2 können eine höhere Anzahl von Gliazellen ergeben und können verwendet werden; Allerdings ist Rückenmarksgewebe in diesem jungen Alter aufgrund der Größe sehr schwer zu sezieren. - Reinigen Sie die Haut des Welpen mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie mit einer feinen Schere die Hautschicht entlang der Mittellinie des Kopfes des Tieres, beginnend kaudal und rostral bewegend, bis Sie die Schnauze erreichen. Vermeiden Sie es, tief in den Schädel zu schneiden, um Gewebeschäden zu vermeiden.
- Den Kopf nach unten neigen, Hautschicht zu jeder Seite des Schädels ziehen und mit einer Federschere einen Schnitt entlang der Schädelmittellinie machen, beginnend am Foramen magnum, wieder kaudal zu rostral schneidend.
- Ziehen Sie mit einer feinen Pinzette die Schädelhälften nach rechts und links und legen Sie den Kortex, das Kleinhirn und den Hirnstamm frei.
- Nach der Freilegung heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel und in die 10 cm große Petrischale, die in Schritt 2.2 vorbereitet wurde. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn unbeschädigt bleibt, um die anatomische Struktur zu erhalten, wobei das Hinterhirn angebracht ist.
- Mit einer feinen, gebogenen Pinzette, bei der die Spitze der Pinzette nach oben zeigt, klemmen Sie das Kleinhirn ab. Entfernen Sie die Hirnhäute und legen Sie sie in ein 15-ml-konisches Röhrchen in den Eiskübel.
- Stellen Sie sicher, dass der Hirnstamm direkt ventral zum Kleinhirn ist und nach Entfernung des Kleinhirns sichtbar ist. Entfernen Sie es mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Hirnhäute und legen Sie es in ein dafür vorgesehenes 15-ml-konisches Röhrchen im Eiskübel.
- Trennen Sie das Mittelhirn vom Kortex, entfernen Sie kortikale Hirnhäute und legen Sie es in eine bestimmte 15-ml-konische Röhre im Eiskübel.
- Um das Rückenmark zu entfernen, legen Sie den enthaupteten Mäusewelpen in Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben liegend) mit der durchtrennten Wirbelsäule in Richtung des Prüfers.
- Erneut mit 70% Ethanol besprühen.
- Schneiden Sie entlang der seitlichen Seiten der Wirbelsäule in rostraler bis kaudaler Richtung durch den Brustkorb bis zu den Hintergliedmaßen. Drücken Sie beim Schneiden die inneren Organe zurück, bis die Wirbelsäule sichtbar ist.
- An jeder Seitenseite der Wirbelsäule abgeschnitten, bis sie isoliert ist, und in die in Schritt 2.2 vorbereitete 10 cm große Petrischale geben.
- Mit der Bauchseite nach oben und mit einer feinen Federschere abwechselnd die rechte und linke Seite jedes Wirbels schneiden, bis die Lendengegend erreicht ist, um das Rückenmarksgewebe freizulegen.
- Entfernen Sie vorsichtig das Rückenmark und die Hirnhäute mit einer feinen Pinzette unter dem Seziermikroskop. In das dafür vorgesehene 15-ml-konische Rohr im Eiskübel geben.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5.-2.19 für jedes Welpen und kombinieren Sie Gewebe aus derselben Region, um die in Schritt 1.2 beschriebenen Kriterien für jeden vorbereiteten T25-Kolben zu erfüllen.
HINWEIS: Entfernen Sie die Hirnhäute so vollständig wie möglich. Wenn eine signifikante Menge an Hirnhäuten verbleibt, wächst der fibroblastenartige Phänotyp der Meningealzellen aus und überwältigt die Zellkultur. Mehrere Rückenmarks, mit gleichem Phänotyp, können kombiniert werden, um eine spezifische Zellkultur zu erzeugen. Achten Sie darauf, dass es nicht zu einer Überfüllung der Zellen kommt, die zu Glia-Apoptose und differentiellen Phänotypen führen kann.
3. Gewebedissoziation
HINWEIS: Alle folgenden Verfahren werden in einer sterilen Gewebekultur, die als Biosicherheitswerkbank bezeichnet wird, unter Verwendung aseptischer Technik und steriler Materialien durchgeführt.
- Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin mit 0,53 mM EDTA zu jedem 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml DMEM und Gewebe hinzu, um die Gewebelyse zu beginnen.
HINWEIS: DMEM enthält eine hohe Menge an Calciumchlorid, das als Inhibitor von Trypsin wirken kann. Wenn die Dissoziation nach den beschriebenen Schritten nicht abgeschlossen ist, kann Hanks' Balanced Salt Solution ohne Kalzium oder Magnesium verwendet werden. Nach der Trypsinisierung kann das Enzym durch Zugabe eines Trypsininhibitors neutralisiert werden, obwohl Kalzium wieder in die Lösung gegeben werden sollte, da es ein Cofaktor für DNase I ist, der in nachfolgenden Schritten verwendet wird. - Triturate mit einer 10 ml Pipette ca. 20x.
- Die Zellsuspensionen werden in leere 50 ml konische Röhrchen überführt.
- Die Lösung bei 37 °C, 5%CO2 für 15 min inkubieren, die Lysate nach 8 min sanft rühren.
- Fügen Sie 5 ml MGM und 200 μL (5 mg/ml) DNase I zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu erhalten.
- Trituieren Sie jedes Lysat mit einer 10 ml Pipette 10x.
- Lassen Sie die Zellsuspensionen 3 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, damit sich nicht dissoziiertes Gewebe am Boden der Röhrchen absetzen kann.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen in neue 50 ml konische Röhrchen und hinterlassen Sie das nicht dissoziierte Gewebe.
HINWEIS: Die oben beschriebenen Lyse- und Verreibungsschritte begrenzen die Menge an nicht dissoziiertem Gewebe erheblich. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 3 min bei 4 °C ohne Bremse.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die verbleibenden Zellpellets in 5 ml MGM.
- Trituieren Sie das Pellet mit einer 5 ml Pipette 20x.
- Die 5-ml-Zellsuspensionen werden auf beschichtete T25-Kolben aufgetragen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 und wechseln Sie das Medium zunächst nach 24 h, um Zelltrümmer zu entfernen.
HINWEIS: Einige Protokolle empfehlen einen ersten Medienwechsel nach 72 h. Eine Optimierung dieses Schritts kann erforderlich sein. - Führen Sie alle 48-72 h einen 100%igen Medienwechsel mit MGM durch, bis die Zellen zu 80% konfluent sind (ca. 5-7 Tage).
HINWEIS: Alle Medien müssen vor dem Medienwechsel auf 37 °C erwärmt werden.
4. Mikroglia Isolierung
- Sobald gemischte Gliakulturen einen Zusammenfluss von 80% erreicht haben, bereiten Sie die Kolben für das Schütteln vor, indem Sie die Deckel festziehen und mit Paraffinfolie verschließen.
- Um Mikroglia aus gemischten Gliakulturen zu entfernen, befestigen Sie die Kolben horizontal auf einem Orbitalschüttler in einem 37-°C-Inkubator. Schütteln Sie die Kolben bei 15 x g für 1 h.
- Medien entnehmen und in ein 15-ml-konisches Röhrchen pipettieren. Spülen Sie die Kolben zweimal mit 3 ml warmem MGM ab und fügen Sie den 15-ml-konischen Röhrchen Wäsche hinzu. Dies sind die Mikroglia.
- 5 ml warmes, frisches MGM in die Kulturkolben geben.
- Kolben mit Paraffinfolie wieder verschließen, Kolben horizontal auf dem Schüttler verschließen und bei 15 x g bei 37 °C für 15 h schütteln, um OPCs von Astrozyten zu trennen.
HINWEIS: Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, aber die 15-stündige Schüttelzeit ist kritisch, da überschüssige Zeit zum Zelltod führen kann. - Zentrifugieren Sie den Überstand aus Schritt 4.3. bei 300 x g für 3 min und Kultur Mikroglia gemäß Standardprotokoll16 oder Verwendung für einen biologischen Assay.
5. Isolierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
HINWEIS: Bei der Beschichtung von OPCs nach der Erstisolierung müssen diese auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche (sterile Platte oder Deckglas) plattiert werden. Bereiten Sie diese Materialien vor Abschluss dieses Abschnitts vor.
- Nach 15 h Schütteln den Überstand aus den Kolben nehmen und auf einer sterilen 100-mm-Petrischale aufschlagen.
- Inkubieren Sie den Überstand bei 37 °C, 5%CO2 für 30 min, schwenken Sie nach 15 min, um die verbleibenden Mikroglia zu entfernen, da diese sehr schnell an der Schale haften. Für diesen Schritt können nicht gewebekulturbehandelte Petrischalen verwendet werden.
- Entfernen Sie den nicht adhärenten Zellüberstand, die Zählung und die Platte auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche. Typischerweise werden 7.500-10.000 OPCs plattiert/cm2.
- Bei 37 °C, 5%CO2 für mindestens 1 h (bis zu 6 h) inkubieren, dann 95% der Medien vorsichtig absaugen und langsam warme OPC-Medien hinzufügen, wobei Medien gegen die Wand des Bohrlochs pipettiert werden, um die Störung von OPCs zu minimieren. Wechseln Sie die Medien alle 48 Stunden, bis die Zellen einsatzbereit sind.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass jeweils nur ein Bohrloch gewechselt wird. OPCs sind empfindlich und besonders intolerant gegenüber trockenen Bedingungen. Die Zugabe von PDGF-AA in OPC-Medien soll die OPC-Reifung zu Oligodendrozyten verzögern. Dieser Faktor kann aus Kulturmedien ausgeschlossen werden, wenn der experimentelle Fokus auf reifen Oligodendrozyten liegt.
6. Astrozyten-Isolierung
- Nach 15 h Schütteln den Überstand entfernen und die Kolben 2x mit warmem 1x PBS abspülen.
- 4 ml 0,05% Trypsin mit 0,53 mM EDTA zugeben und bei 37 °C, 5%CO2 für 5 min oder bis sich die Zellen gehoben haben, inkubieren. Um sicherzustellen, dass sich die Astrozyten gehoben haben, visualisieren Sie sie mit einem Standard-Weitfeldmikroskop. Astrozyten erscheinen nach der Trypsinisierung kugelförmig.
- Sobald sich die Astrozyten gelöst haben, stellen Sie den Kolben senkrecht und fügen Sie 4 ml MGM hinzu. Triturate zum Mixen.
- Astrozyten in ein 15 ml konisches Röhrchen pipettieren, bei 300 x g für 5 min zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie Astrozyten in Astrozytenmedien und Platten auf fibronektinbeschichteter Oberfläche wie in Schritt 1.2 beschrieben. oder Verwendung für biologische Assays.
HINWEIS: 20 ng / ml muriner Fibroblasten-Wachstumsfaktor kann während des ersten Medienwechsels hinzugefügt werden, um die Etablierung der Astrozytenkultur zu unterstützen. Darüber hinaus kann eine Standardgelatinebeschichtung eine kostengünstige Alternative zu Fibronektin sein.
7. Identifizierung und Isolierung von Mikroglia, OPCs, Astrozyten und reifen Oligodendrozyten mittels Immunzytochemie
- Sobald die plattierten Zellen die entsprechende Konfluenz erreicht haben, entfernen Sie vorsichtig Medien und fixieren Sie die adhärenten Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten. Führen Sie diesen Schritt in einer Biosicherheitswerkbank aus.
HINWEIS: Wenn Sie Lösungen absaugen oder hinzufügen, pipetten Sie mit leichtem Druck, um eine Zellablösung zu verhindern. - PFA langsam absaugen und dann die Zellen 3x mit 1x PBS für 5 min waschen.
- Bereiten Sie eine geeignete Blocklösung mit 10% Serum und 0,1% Triton X-100 in 1x PBS vor.
HINWEIS: Die Serumquelle spiegelt das Wirtstier wider, bei dem der sekundäre Antikörper hochgezogen wurde. Wenn der sekundäre Antikörper beispielsweise Ziegen-Anti-Kaninchen ist, ist das geeignete blockierende Serum normales Ziegenserum. Ebenso, wenn der sekundäre Antikörper Esel Anti-Kaninchen ist, sollte das blockierende Serum normales Eselserum sein. - Fügen Sie eine blockierende Lösung hinzu, bis die Zellen vollständig bedeckt sind. Block für 1 h bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine Antikörperverdünnungslösung her (9 ml 1x PBS, 0,01 g Rinderserumalbumin, 30 μL Triton X-100). Alternativ können Antikörper in der in Schritt 6.3 beschriebenen Blocklösung verdünnt werden.
- Verdünnen Sie primäre Antikörper, die spezifisch für Folgendes sind, in Antikörperverdünnungs- oder Blockierungslösung:
- Mikroglia: ionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1 (Iba1) in einer Verdünnung von 1:250 (2,4 μg/ml).
- OPCs: Neural-/Gliaantigen 2 (NG2) in einer Verdünnung von 1:200 (5 μg/ml).
- Reife Oligodendrozyten: Myelin-Basisprotein (MBP) in einer Verdünnung von 1:400 (Konzentration ist chargenabhängig und eine Optimierung kann erforderlich sein).
- Astrozyten: saures Gliafibrillenprotein (GFAP) in einer Verdünnung von 1:400 (0,25 μg/ml)17.
HINWEIS: Mischen Sie keine primären Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden.
HINWEIS: GFAP markiert zuverlässig Astrozyten der weißen Substanz. Für Astrozyten der grauen Substanz muss möglicherweise ein alternativer Marker verwendet werden.
- Primärer Antikörper über Nacht bei 4 °C inkubieren (mit leichtem Rühren ist wünschenswert).
- 3x mit 1x PBS für 5 min waschen, um den primären Antikörper zu entfernen.
- Inkubieren Sie Zellen mit geeigneten sekundären Antikörpern in einer Verdünnung von 1:400 in lichtgeschützter Antikörperverdünnungs- oder Blocklösung.
HINWEIS: Sekundäre Antikörper werden an ein Fluorophor konjugiert, das je nach verfügbaren Mikroskopparametern ausgetauscht werden kann. Sobald fluoreszierende sekundäre Antikörper aufgetragen wurden, so weit wie möglich vor Licht schützen. - Inkubieren Sie sekundäre Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur und begrenzen Sie die Lichtexposition.
- 3 mal mit 1x PBS für 5 min waschen, um überschüssige sekundäre Antikörper zu entfernen.
- Um Kerne zu markieren, verwenden Sie eine 1:1.000 DAPI/PBS-Lösung und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- 3x mit 1x PBS 5 min im Dunkeln waschen.
- Zur Montage Montagemedien auftragen und vor der Aufnahme im Dunkeln trocknen lassen.
HINWEIS: Gerahmte Dias können 2-3 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Für eine Langzeitlagerung die Dias auf 4 °C verschieben. Bild innerhalb einer Woche für maximales Signal. Alle repräsentativen Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen; Es werden jedoch auch inverse Fluoreszenzmikroskope empfohlen.
Representative Results
Die unten gezeigten repräsentativen Daten zeigen, dass die IFNγ-Signalisierung die OPC-Differenzierung und -Reifung beeinflusst. Ohne das Vorhandensein des IFNγ-Rezeptors (IFNγR) differenzieren kortikale OPCs nicht so leicht in reife myelinisierende Oligodendrozyten, was durch das Fehlen einer MBP-Färbung belegt wird (Abbildung 1). Da Oligodendrozyten und Astrozyten von einem gemeinsamen Vorläufer abgeleitet sind, analysierten wir die GFAP-Expression, die Astrozyten kennzeichnet. Wir fanden heraus, dass IFNγR-defiziente Zellen GFAP stark exprimieren, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise einen astrozytären Phänotyp annehmen, was frühere Berichte bestätigt19.
Zusätzliche Hinweise auf regionale Heterogenität in ZNS-Zellen werden durch eine variierende Astrozytenmorphologie belegt, wie sie in Astrozyten aus Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark beobachtet wird (Abbildung 2). Bemerkenswert ist, dass Astrozyten aus derselben Region auch morphologische Heterogenität aufweisen können, was die Annahme unterstützt, dass dieser Gliasubtyp hochdynamisch ist. Die Unterschiede in der Zellarchitektur deuten auf funktionelle Vielfalt hin, und daher ist die Fähigkeit, Gliapopulationen zu isolieren, notwendig, um phänotypische Reaktionen in Abwesenheit und Anwesenheit von Mikroumweltreizen zu untersuchen.
Oligodendrozyten sind entscheidend für die Myelinisierung neuronaler Axone und sind für die richtige ZNS-Reparatur und -Funktion notwendig. OPCs führen zu ihren ausgereiften Gegenstücken, weshalb es wichtig ist, die Biologie hinter ihrer Differenzierungsfähigkeit zu verstehen. Die Zytokinsignalisierung beeinflusst maßgeblich das Verhalten von Stamm- und Immunzellen. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie regionale Reaktionen von OPCs auf die differentielle Zytokinstimulation variieren können (Abbildung 3), was sich auf ihre Fähigkeit auswirken kann, sich in reife myelinisierende Oligodendrozyten zu differenzieren.
Abbildung 1: Repräsentative Daten zur OPC-Differenzierung bei WT- und IFNγR-/- Mäusen in Gegenwart von exogenem IFNγ. Kortikale OPCs wurden aus ( A ) WT und (B) IFNγR-/- P4 Mauswelpen nach dem oben beschriebenen Verfahren isoliert. Die Zellen wurden 48 h lang mit 1 ng/ml IFNγ behandelt, dann fixiert und gefärbt, um die Zelldifferenzierung abzugrenzen. OPCs wurden für NG2 und GFAP markiert, um diejenigen zu identifizieren, die einen astrozytären Phänotyp annahmen. Ebenso wurden OPCs auch für NG2 und MBP markiert, um diejenigen zu identifizieren, die sich in reife Oligodendrozyten differenzierten. Maßstabsbalken = 20 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Daten zur regionalen Heterogenität der Astrozytenmorphologie. Astrozyten aus Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark wurden aus P4-Mauswelpen unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls isoliert und durch Immunzytochemie nach 48 h in Kultur für GFAP (grün) markiert. Maßstabsbalken = 20 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Daten, die differentielle Reaktionen regionaler OPCs auf Zytokine zeigen. OPCs wurden aus dem Hirnstamm und Rückenmark von P4-Mauswelpen unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls isoliert. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen (1-10 ng/ml) von (A) IFNγ oder (B) Interleukin (IL)-17 behandelt, um den differentiellen Einfluss von Zytokinen auf die Fähigkeit regionaler OPCs zur Differenzierung in myelinisierende Oligodendrozyten zu untersuchen. Nach einer 48-stündigen Inkubation mit spezifizierten Zytokinen wurden OPCs fixiert und für NG2 (grün) und MBP (rot) markiert. Maßstabsbalken = 20 μM. Daten stellen Mittel ± SEM dar. **, p < 0,01; , S. < 0,001; , p < 0,0001 durch 2-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| PBS/Antibiotikalösung (PAS): | ||
| 1,0 ml | 100X Antibiotikum/Antimykotikum mit 10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 mg/ml Streptomycin | |
| 25 mg/ml | Amphotericin B | |
| 99 ml | 1X PBS | |
| Gemischte Glia-Medien (MGM) | ||
| 88 ml | 1X DMEM (hohe Glukose, w/L-Glutamin, w/Na-Pyruvat) | |
| 10 ml | Wärmeinaktiviertes FBS | |
| 1,0 ml | L-Glutamin (100X) | |
| 1,0 ml | Antibiotikum/Antimykotikum | |
| OPC-Medien (50 ml) | ||
| 49 ml | Neurobasale Medien | |
| 1,0 ml | B27 Ergänzung (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| HINWEIS: PDGF-AA wird vor jedem Medienwechsel neu hinzugefügt. | ||
| Astrozyten-Medien (1 L) | ||
| 764 ml | MEM mit glutaminhaltigen Earle-Salzen | |
| 36 ml | Glukose (verwenden Sie 100 mg / ml Brühe für die Endkonzentration von 20 mM) | |
| 100 ml | Wärmeinaktiviertes FBS | |
| 100 ml | Hitzeinaktiviertes Pferdeserum | |
| 10 ml | Glutamin (verwenden Sie 200 mM Vorrat, wenn nicht im Lagermedium enthalten) | |
| OPTIONAL: 10 ng/ml rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor der Maus | ||
| HINWEIS: Alle Medien steril filtern und bei 4 °C lagern, bis sie verwendet werden. | ||
Tabelle 1: Puffer- und Medienrezepte.
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung der drei wichtigsten Gliazellsubpopulationen aus dem Maus-ZNS: Mikroglia, OPCs und Astrozyten. Ein großer Rückschlag für die Untersuchung neurodegenerativer und neuroinflammatorischer ZNS-Erkrankungen ist der Mangel an primären menschlichen Zellen und Geweben, insbesondere solchen, die regional sind und vom selben Patienten stammen. In den meisten Fällen stammen menschliche ZNS-Zelllinien von transformierten, immortalisierten Krebszellen, die möglicherweise keine genauen Darstellungen ihres normalen physiologischen Verhaltens darstellen20,21,22. Daher sind alternative Methoden notwendig, um ZNS-Zellphänotypen kontrolliert zu untersuchen. Darüber hinaus macht es die Vielfalt neurologischer Gliazellpopulationen notwendig, jeden Subtyp sowohl unabhängig voneinander als auch unter Kokulturbedingungen zu untersuchen, um sowohl ihre zellautonomen als auch ihre nicht-autonomen Funktionen zu rekapitulieren. Gliazellen haben eine Vielzahl kritischer Funktionen im ZNS, die von neuronaler Unterstützung23, Lernen/Kognition24,25 und immunologischen Reaktionen des ZNS26 reichen. Daher ist es notwendig, die molekularen und zellulären Funktionen jeder glialen Subpopulation in einem physiologischen und pathologischen Kontext zu verstehen. Um dies zu tun, stellen wir hier eine zuverlässige Methode zur Extraktion und Isolierung lebensfähiger Glia-Subtypen zur Verfügung. Aufgrund praktischer und ethischer Einschränkungen in der Forschung am Menschen sind Tiermodelle derzeit die relevantesten Surrogate für die menschliche Gliazellbiologie. Insbesondere Mäuse sind ideale Modelltiere, da ihr Genom manipuliert und analysiert werden kann, um bestimmte molekulare Mechanismen, die Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen, weiter zu analysieren. Daher ist die erfolgreiche Entfernung und Trennung von murinen Mikroglia, OPCs und Astrozyten ein Schlüsselwerkzeug, um die Funktionen von Gliazellen bei physiologischen, neurodegenerativen oder neuroinflammatorischen Erkrankungen zu untersuchen.
Dieses Protokoll kann optimiert werden, um die regionale Heterogenität von ZNS-Zellen zu untersuchen. Es wird immer deutlicher, dass Gliazellen regionale Heterogenität in Form und Funktion aufweisen. Astrozyten sind regional vielfältig und zeigen je nach Lage im ZNS27 eine unterschiedliche Morphologie. Darüber hinaus können die Dichte der Astrozyten und ihr mitotischer Index anatomische Regionen definieren, was die Hypothese unterstützt, dass die regionale Astrozytenheterogenität molekulare und funktionelle Unterschiede aufgrund ihrer Position innerhalb des ZNSwiderspiegeln kann 28. Die regionale Heterogenität der Mikroglia wird ebenfalls aktiv untersucht, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen und funktionellen Konsequenzen der Mikroglia-Diversität bei der Entwicklung oder dem Verhalten des ZNS derzeit unklar sind. Es ist jedoch bekannt, dass adulte Mikroglia Diversität in Zellzahl, Zell- und subzellulären Strukturen und molekularen Signaturen aufweisen29. Darüber hinaus haben die jüngsten Fortschritte in der Multiplex-Massenzytometrie die regionale Heterogenität von Mikroglia weiter definiert, indem der zelluläre Phänotyp aus fünf verschiedenen ZNS-Regionen von neun menschlichen Spendern analysiert wurde, was eine groß angelegte Immunphänotypisierung menschlicher Mikroglia ermöglicht30. Derzeit befinden sich solche Ansätze in einem Anfangsstadium, was Tierstudien zu einer praktikablen Lösung für die Untersuchung regionaler Glia bei der Entwicklung von ZNS-Erkrankungen macht. Schließlich wurde kürzlich auch regionale Heterogenität in Oligodendrozyten beschrieben. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung an 5072 Einzelzellen aus 10 Regionen des juvenilen und adulten ZNS identifizierte 13 verschiedene Subpopulationen in verschiedenen Differenzierungsstadien31. Wichtig ist, dass mit der Reifung von Oligodendrozyten aus OPCs ihre Transkriptionsprofile divergierten und sich ihre funktionellen Phänotypen veränderten, was die Oligodendrozytenheterogenität innerhalb des ZNSunterstreicht 31.
Daher kann das Verständnis der regionalen Heterogenität der verschiedenen residenten ZNS-Zellen im Kontext ihrer verschiedenen benachbarten Neuronen und anderer Gliazellen wichtige Gründe für die zukünftige Entwicklung neuartiger Therapien zur Behandlung neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Erkrankungen liefern. Während sich dieses Protokoll auf die Extraktion, Isolierung und Identifizierung von Gliasubpopulationen konzentriert, bietet es einen geeigneten Ausgangspunkt für die Untersuchung ihrer Funktion. Darüber hinaus kann es angepasst und mit transgenen Mausmodellen kombiniert werden, um genetische Mechanismen der Gliazellbiologie zu untersuchen. Es kann auch verwendet werden, um die Reaktionen von Gliazellen aufeinander in Co-Kultur-Assays zu untersuchen. Die skizzierten Schritte stellen eine kostengünstige Hochdurchsatzmethode zur Extraktion und Isolierung verschiedener ZNS-Gliapopulationen dar, die dann an eine Vielzahl von experimentellen Parametern angepasst werden können. Es sollte beachtet werden; Die hier beschriebene Methode verwendet jedoch Neugeborene aufgrund der geringeren Myelinisierung und der hohen Dichte der proliferierenden Glia. Aus diesen Gründen ist es technisch machbarer, lebensfähige Gliazellen aus Neugeborenen im Vergleich zu erwachsenen Tieren zu isolieren. Die phänotypischen Unterschiede zwischen neonataler Glia und adulter Glia sollten daher bei der experimentellen Planung und Dateninterpretation berücksichtigt werden.
Disclosures
Die Autoren haben Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Morgan Psenicka für die Bearbeitung und Diskussion des Manuskripts und Dr. Grahame Kidd für die Unterstützung bei der Formatierung der Abbildungen. Diese Arbeit wurde von NIAID K22 AI125466 (JLW) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
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