Um pipeline usando eletroporação bilateral no útero para interrogar influências genéticas no comportamento dos roedores
Summary
O papel dos genes recentemente descobertos associados à doença na patogênese das doenças neuropsiquiátricas permanece obscuro. Um bilateral modificado na técnica de eletroporação uterómis permite a transferência genética em grandes populações de neurônios e o exame dos efeitos causadores das mudanças na expressão genética no comportamento social.
Abstract
Como estudos de associação genoma lançam luz sobre os fundamentos genéticos heterogêneos de muitas doenças neurológicas, a necessidade de estudar a contribuição de genes específicos para o desenvolvimento cerebral e a função aumenta. Contar com modelos de camundongos para estudar o papel de manipulações genéticas específicas nem sempre é viável, uma vez que as linhas de camundongos transgênicos são bastante caras e muitos novos genes associados a doenças ainda não têm linhas genéticas disponíveis comercialmente. Além disso, pode levar anos de desenvolvimento e validação para criar uma linha de mouse. No útero a eletroporação oferece um método relativamente rápido e fácil para manipular a expressão genética de uma maneira específica do tipo celular in vivo que só requer o desenvolvimento de um plasmídeo de DNA para alcançar uma manipulação genética particular. Bilateral na eletroporação do útero pode ser usado para atingir grandes populações de neurônios piramixais do córtex frontal. A combinação desse método de transferência genética com abordagens comportamentais permite estudar os efeitos das manipulações genéticas na função das redes de córtex pré-frontal e no comportamento social de camundongos juvenis e adultos.
Introduction
Estudos de associação genoma (GWAS) têm impulsionado a descoberta de novos genes candidatos que estão associados às patologias cerebrais1,2,3,4. Esses estudos têm sido particularmente benéficos na compreensão de distúrbios neuropsiquiátricos devastadores, como a esquizofrenia (SCZ), onde a investigação de novos genes tem servido como ponto de lançamento para novas linhas de pesquisa e intervenção terapêutica5,6. Genes que abrigam risco para SCZ apresentam expressão tendenciosa no córtex pré-frontal (CPF) durante o desenvolvimento pós-natal e pós-natal precoce, região implicada na patologia de vários distúrbios neuropsiquiátricos7. Além disso, modelos de camundongos de transtornos psiquiátricos apresentam atividade anormal nas redes PFC6,8,9. Esses resultados sugerem que os genes associados ao SZC podem desempenhar um papel na fiação de desenvolvimento desta região. Uma investigação mais aprofundada utilizando modelos animais é necessária para compreender a contribuição desses genes candidatos para o estabelecimento de conexões no PFC e determinar se esses genes têm um papel causador na patogênese das doenças neuropsiquiátricas. Técnicas de manipulação genética em camundongos que permitem o estudo de mudanças na expressão genética em circuitos neuronais específicos durante o desenvolvimento pré-natal e pós-natal precoce são um método promissor para entender os mecanismos moleculares que ligam as mudanças de expressão genética à disfunção do FPF.
Linhas genéticas de camundongos oferecem um método para estudar o impacto de determinados genes no desenvolvimento e função cerebral. No entanto, depender de camundongos transgênicos pode ser limitador, uma vez que nem sempre existem linhas disponíveis comercialmente para examinar os efeitos de genes específicos no desenvolvimento de circuitos neurais. Além disso, pode ser extremamente caro e demorado para desenvolver linhas personalizadas de mouse. O uso de estratégias interseccionais de manipulação genética que combinam camundongos transgênicos com abordagens virais revolucionou a compreensão do cérebro10,11,12. Apesar de muito progresso, as estratégias virais vêm com certas limitações dependendo do tipo vetorial viral, incluindo limites na capacidade de embalagem que podem restringir a expressão viral13 e a toxicidade celular associada à expressão viral14. Além disso, na maioria das condições experimentais, a expressão genética robusta usando o vírus associado ao Adeno (AAVs) requer aproximadamente 2 a 4 semanas15, tornando inviáveis estratégias virais rotineiras para manipular genes durante o desenvolvimento pós-natal precoce.
No útero a eletroporação (IUE) é uma abordagem alternativa que permite uma transferência genética rápida e barata16,17 que, quando acoplado à rotulagem fluorescente e abordagens farmacogenéticas ou optogenéticas, fornece uma plataforma poderosa para dissecar a função dos circuitos neuronais. Além disso, com o desenvolvimento de genes de edição de genomas CRISPR-Cas9 pode ser superexpresso ou precisamente alterado através de knock-down ou knock-out específicos do tipo celular ou através da modulação dos promotores18,19. As abordagens de manipulação genética usando iUE são especialmente vantajosas quando o efeito dos genes em circuitos neuronais precisa ser testado durante janelas de desenvolvimentoestreitas 20. IUE é uma técnica versátil e a superexpressão pode ser facilmente realizada inserindo um gene em um vetor de expressão sob um promotor específico. O controle adicional da expressão genética pode ser alcançado através da expressão de condução usando promotores de diferentes pontos fortes ou usando promotores induíveis capazes de controlar temporalmente a expressão genética21,22. Além disso, a IUE permite o direcionamento de células dentro de camadas corticais específicas, tipos de células e regiões cerebrais, o que nem sempre é viável usando outras abordagens5,17. Os recentes avanços na configuração da IUE com base no uso de três eletrodos, que geram uma distribuição de campo elétrico mais eficiente, expandiram o repertório funcional deste método e permitiram aos cientistas direcionar novos tipos de células e aumentar a eficiência, precisão e número de células que podem ser alvode 23,24. Esta técnica foi recentemente utilizada para determinar o papel causador do componente complementar 4A (C4A),gene ligado ao SCZ, na função PFC e na cognição precoce5.
Apresentado aqui é um pipeline experimental que combina abordagens de transferência genética para atingir grandes populações de neurônios excitatórios no córtex frontal, incluindo o PFC, com paradigmas comportamentais que não só permitem o estudo de mudanças de nível celular e circuito, mas também permite que o comportamento seja monitorado durante o desenvolvimento pós-natal e a idade adulta. Descrita pela primeira vez é um método para transfetar bilateralmente grandes populações de neurônios pirambulais de camada (L) 2/3 em regiões corticais frontais. Em seguida, são delineadas tarefas para avaliar o comportamento social em camundongos juvenis e adultos. A contagem celular pode ser obtida após a conclusão de tarefas comportamentais para quantificar a extensão e a localização da transfecção celular. Além disso, o número de células transfeinadas pode ser correlacionado com dados comportamentais para determinar se um maior número de células transfeinadas leva a maiores perturbações no comportamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um oleoduto é descrito que combina a manipulação de novos genes de interesse em grandes populações de neurônios corticais frontais com ensaios comportamentais em camundongos. Além disso, este pipeline permite o estudo longitudinal do comportamento nos mesmos camundongos, tanto durante o desenvolvimento pós-natal precoce quanto na idade adulta. Essa técnica contorna a necessidade de contar com modelos genéticos de animais que podem ser caros em termos de tempo e despesas. A força deste protocolo é que el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Lisa Kretsge pelo feedback crítico e edição do manuscrito. Agradecemos a todos os assistentes de pesquisa do laboratório Cruz-Martín que foram inestimáveis em ajudar com perfusões e contagem celular de cérebros comportamentais. Agradecemos a Andrzej Cwetsch pela contribuição sobre o design do eletrodo tripolar, e Todd Blute e o Núcleo de Imagem de Biologia da Universidade de Boston pelo uso do microscópio confocal. Este trabalho foi apoiado por um Narsad Young Investigator Grant (AC-M, #27202), o Brenton R. Lutz Award (ALC), o I. Alden Macchi Award (ALC), o NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) e o Boston University Research Opportunities Program (WWY). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
Referências
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