تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري
Summary
لم يتم بشكل كامل تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن البؤر الناجمة عن الإشعاع (RIF) من البروتينات الإصلاح عن طريق تلطيخ المناعة في خطوط خلايا سرطان القولون البشرية بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط.
Abstract
الغرض من المخطوطة هو توفير بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء المجهر المناعي لدراسة استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع الناجم عن شعاع النيوترون غاما المختلط المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). على وجه التحديد، يتم تطبيق المنهجية المقترحة للكشف عن تنشيط البروتينات إصلاح التي يمكن تصورها البؤر باستخدام الأجسام المضادة محددة لفواصل الحمض النووي مزدوجة حبلا (DNA-DSBs). تم تقييم بؤر إصلاح الحمض النووي عن طريق الفلوروسين المناعي في خلايا سرطان القولون (HCT-116) بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط. الحمض النووي DSBs هي الآفات الأكثر سمية جينية ويتم إصلاحها في خلايا الثدييات من خلال مسارين رئيسيين: مسار غير متماثل للانضمام النهائي (NHEJ) وإصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR). الترددات من بؤر, ملطّخة مناعيا, لعلامات شائعة الاستخدام في علم الأحياء الإشعاعية مثل γ-H2AX, 53BP1 ترتبط مع الحمض النووي DSB عدد وتعتبر علامات فعالة وحساسة لرصد تحريض وإصلاح الحمض النووي DSBs. وقد ثبت أن γ-H2AX تجمع البروتينات الإصلاح, مما يؤدي إلى تركيز أعلى من عوامل الإصلاح بالقرب من DSB. لرصد تلف الحمض النووي على المستوى الخلوي، تم التخطيط لتحليل الفلور المناعية لوجود الحمض النووي-PKcs ممثل إصلاح بؤر البروتين من مسار NHEJ و Rad52 من مسار HRR. لقد قمنا بتطوير وإدخال بروتوكول تلطيخ مناعة موثوق به للكشف عن استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع مع أجسام مضادة خاصة بعوامل الإصلاح من مسارات NHEJ و HRR وocioci التي يسببها الإشعاع (RIF). ويمكن استخدام المنهجية المقترحة في فحص بروتين الإصلاح الذي يتم تنشيطه بدرجة كبيرة في حالة إشعاع الشعاع المختلط النيوترون، مما يشير إلى هيمنة مسار الإصلاح.
Introduction
لم يتم تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT) بشكل كامل. يوفر هذا البروتوكول إجراءً تدريجيًا لتنفيذ الكشف عن البؤر المستحثة بالإشعاع (RIF) من البروتينات المُعدة عن طريق تلطيخ الفلورس المناعية، على سبيل المثال، في خط الخلايا السرطانية القولونية البشرية بعد التشعيع مع الشعاع المختلط النيوتروني.
الإشعاع المؤين (IR) يحفز العديد من أنواع مختلفة من الضرر الحمض النووي (الحمض النووي DSBs، الحمض النووي-SSBs، الحمض النووي الضرر قاعدة) من الذي فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا هي الآفات الحمض النووي الأكثر سمية جينية1. يمكن أن تؤدي الفواصل غير المُعاد إصلاحها إلى موت الخلايا، بينما تثير الفواصل التي تم إصلاحها بشكل خاطئ احتمال إعادة ترتيب الكروموسومات، ونشوء الطفرات، وفقدان المعلومات الوراثية الحاسمة. وتشمل مسارات الاستجابة للأضرار استجابة DSBs مسارات إصلاح الحمض النووي مثل الانضمام نهاية غير متجانسة (NHEJ)، وهي الآلية التي تتطلب كو 70/80، الحمض النووي PKcs، Xrcc4، والحمض النووي الرابع كعوامل رئيسية2،,3،,4،,5،,6. في الثدييات، المسار الرئيسي الثاني لإصلاح الحمض النووي هو مسار إصلاح إعادة التركيب المتجانس (HRR) الذي يتطلب مكونات رئيسية – عائلة جينات الغطاس Rad52 – Rad51 و Rad52 و Rad54 و Rad55 و Rad57 و Rad587. Rad51 و Rad54 هي عوامل إعادة الكومبين البشري الرئيسية المشاركة في آليات الإصلاح المتعلقة الإجهاد النسخ المتماثل وفواصل الحمض النووي في eukaryotes. ومن المثير للاهتمام، لوحظ أن الهابط من مسار HR يعزز مسار NHEJ الذي هو عرضة للخطأ مشيرا إلى أهمية مسار الموارد البشرية للاستقرار الجينوم8.
الخطوة الأولى من تشكيل DSBs هو الفوسفور من حجر الستون γ-H2AX في سير-139 بواسطة أتاكسيا تيلانجيكتاسيا تحور كيناز (ATM) من الأسرة كيناز PI37,8. ومن المثير للاهتمام، يمكن تصور الفوسفور H2AX بسهولة عن طريق تقنية مناعية الفلوروسكين كما foci (γ-H2AX بؤري) باستخدام الأجسام المضادة محددة لH2AX6الفوسفورية . هناك علاقة 1:1 بين عدد DSBs و γ-H2AX بؤر، لذلك، DSB علامة، γ-H2AX، ودرس على نطاق واسع من خلال توصيف تشكيل بؤر، وحجم، وكمية6،,7،,8،,9،,10،,11. تشكيل γ-H2AX بؤر يؤدي إلى تجنيد وتراكم الحمض النووي استجابة الضرر (DDR) البروتينات والعوامل المعدلة الكروماتين، مثل 53BP1 (p53 بروتين ملزمة 1)، MDC1 (وسيط نقطة تفتيش الضرر الحمض النووي)، BRCA1، Mre11/Rad50/Nbs1، PARP-1، والعديد من العوامل الأخرى إصلاح تشكيل عوامل أخرى من ذلك foci الناجمة عن الإشعاع (RIF). كل هذه البروتينات تشارك في التوطين مع γ-H2AX من خلال الربط المباشر أو غير المباشر1,11,12.
من المهم الكشف عن تلف الحمض النووي وإصلاح مع اختبار حساس السليم، وبالتالي، يتم إيلاء المزيد من الاهتمام لتطوير تقنيات دقيقة للغاية13. وفي سياق دراسات تلف الحمض النووي وإصلاحه، تعتبر المنهجية حاسمة بالنسبة للكشف الحساس عن تلف الحمض النووي الجيني، ووصف فئة الضرر، وتحديد كمية الضرر بالحمض النووي وآليات الإصلاح13. للكشف عن خلايا واحدة مع الحمض النووي التالفة، ويستخدم عادة في اختبار المذنبات الدراسات البيولوجية الإشعاعية14. تتعرف الطرق الخلوية الأخرى المتاحة على الانحرافات الكروموسومية، بما في ذلك الزخرف، والتوابل، والشظايا المركزية، والخواتم، والانحرافات من النوع الكروماتي، وتلف الكروموسومات بالنواة الدقيقة (Mn). الطريقة الأكثر استخداما في البيولوجيا الإشعاعية، وخاصة في قياس الجرعات البيولوجية، هو المقايسة الكروموسوم الزناة نظرا لخصوصيته العالية للإشعاع15. على سبيل المثال، لا يمكن أن يتعرف PCR، وهو أسلوب جزيئي كلاسيكي، على نوع تلف الحمض النووي المكتشف. في هذه الحالة، طرق المناعة تمرير مستوى الحساسية لأن ردود الفعل محددة بين المستضد والأجسام المضادة. يوفر التصوير المناعي للفلوريسين دليلاً مرئياً لظهور بروتينات مختلفة في بؤر مميزة استجابة لعوامل ضارة بالحمض النووي مثل الإشعاع المؤين16. ومع ذلك ، فإن مستويات التنشيط من الضرر وإصلاح البروتينات ‘مرنا مستويات يمكن اكتشافها بسهولة عن طريق PCR في الوقت الحقيقي الذي هو وسيلة كمية مناسبة لمزيد من الدراسات الجزيئية في سياق الاستجابة لتلف الحمض النووي17.
مع الأخذ في الاعتبار أن γ-H2AX بؤر جذب عوامل الإصلاح18، لرصد تلف الحمض النووي وإصلاح على المستوى الخلوي ، قمنا بتطوير إجراء تلطيخ المناعة موثوقة ، استنادا إلى تحليل بؤر البروتين إصلاح ممثل من مسار NHEJ (الحمض النووي – PKcs) و Rad52 من مسار HRR.
هنا، نقترح استخدام المناعي لهذه البروتينات باعتبارها الإجراء الفعال والحساس لرصد الحمض النووي-DSB التعريفي وإصلاح. حتى الآن، لم تكن هناك بيانات متوفرة عن الحمض النووي DSBs على أساس بؤر البروتينات إصلاح على المستوى الخلوي بعد النيوترونات شعاع مختلط تشعيع لBNCT، باستثناء γ-H2AX و 53BP1 علامات19. نقترح تكييف خط خلايا سرطان القولون HCT-116، كما هو غني في نفسه في بؤر DSBs، كخط خلية قياسي لتحليل تلف الحمض النووي، لأن RIFs يمكن اكتشافها بسهولة. هذا الخط الخلية المنضمة من السهل الحفاظ على ومناسبة لإجراءات التشعيع. ويستند الإجراء المقترح على كمية كبيرة من الدراسات السابقة المتعلقة بإجراء المناعة العامة من تلطيخ γ-H2AX. ومع ذلك، فإنه يتضمن جميع التفاصيل المتعلقة باختيار الأجسام المضادة المناسبة مع التخفيفات اختبار لكل بروتين ممثل تنتمي إلى كل مسار إصلاح. وعلاوة على ذلك، فإنه يصف استخدام شعاع فريد من نوعه النيوترون مختلطة المستخدمة في العلاج BNCT. ومع ذلك، نوصي بتوسيع الدراسات مع كلا الأسلوبين، مناعية تلطيخ أولا ثم، مع تحليل الجزيئية عالية التكلفة كما أجريت سابقا4،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترددات بؤر، الملطخة مناعيا ل γ-H2AX و 53BP1 تستخدم عادة في البيولوجيا الإشعاعية وترتبط مع عدد الحمض النووي DSB وتعتبر علامات فعالة وحساسة لرصد تحريض وإصلاح الحمض النووي DSBs19. إن إجراء التلطيخ المشترك للـ γ-H2AX و 53BP1 هو إجراء قياسي للكشف عن الحمض النووي DSBs. ويرتبط تشكيل γ-H2AX مع توظيف 53BP1?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتم الحصول على الشعاع النيوتروني المختلط المكون من إشعاع النيوترون/غاما من مفاعل ماريا للبحوث في المركز الوطني للبحوث النووية في بولندا. 11- وقد تلقى المركز الوطني للعلوم في بولندا (Miniatura 2) دعماً من المركز الوطني للعلوم( منحة رقم #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
Referências
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Pesquisa do Câncer. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
