بلازموديوم فالسيباروم ثقافة الخلايا الجامائية والعدوى البعوض من خلال تغذية الغشاء الاصطناعي
Summary
وتكريس التحريات المفصلة بشأن مراحل البعوض في طفيليات الملاريا أهمية حاسمة في تصميم استراتيجيات فعالة لمنع انتقال العدوى. يوضح هذا البروتوكول كيفية استزراع خلايا اللعب المعدية بشكل فعال ومن ثم تغذية هذه الخلايا اللعبة للبعوض لتوليد مراحل البعوض من P. falciparum.
Abstract
ولا تزال الملاريا واحدة من أهم مشاكل الصحة العامة، مما يسبب معدلات كبيرة من الاعتلال والوفيات. الملاريا مرض ينتقل عن طريق البعوض ينتقل عن طريق لدغة معدية من أنثى بعوضة الأنوفيليس. وستعتمد مكافحة الملاريا في نهاية المطاف على العديد من النهج، التي تشمل سبل منع انتقال العدوى من البعوض وعبره ومنه. لدراسة مراحل البعوض من طفيليات الملاريا في المختبر ، قمنا بتحسين بروتوكول زراعة خلايا الخلايا المنجلية المنجلية عالية العدوى ، وهي مرحلة طفيلية مطلوبة للانتقال من المضيف البشري إلى ناقل البعوض. P. فالسيباروم gametocytes تنضج من خلال خمس خطوات متميزة شكليا، والذي يستغرق ما يقرب من 1-2 أسابيع. يتم الانتهاء من ثقافة الخلايا المغموسة الموصوفة في هذا البروتوكول في 15 يوما وهي معدية للبعوض من أيام 15-18. وقد وضعت هذه البروتوكولات للحفاظ على دورة مستمرة من الخلايا اللعبة المختصة العدوى والحفاظ على إمدادات دون انقطاع من مراحل البعوض من الطفيلي. هنا ، نصف منهجية زراعة الخلايا الغامقة وكيفية إصابة البعوض بهذه الطفيليات باستخدام مغذيات الأغشية الزجاجية.
Introduction
تحدث الملاريا بسبب طفيليات البلازموديوم وتنتقل إلى مضيفيهم الفقاريين عن طريق لدغة معدية من بعوض الأنوفيليس الأنثوي. ووفقا لتقرير منظمة الصحة العالمية لعام 2019، كان هناك ما يقدر بنحو 405,000 حالة وفاة، من إجمالي 228 مليون حالة إصابة بالملاريا1. وتركزت معظم الوفيات المتصلة بالملاريا في المنطقة الأفريقية، ولا سيما بين الأطفال دون سن الخامسة. وفي حين انخفض المعدل العام للإصابة بالملاريا على الصعيد العالمي منذ عام 2010، فقد استقر الانخفاض في السنوات الأخيرة، وهناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات إضافية لمكافحة المرض.
مراحل الدم اللاجنسية الدورية من طفيليات الملاريا تسبب مرض الإمراض وفئة فرعية صغيرة من هذه تفرق إلى خلايا اللعبة الإناث والذكور. Plasmodium falciparum gametocytes هي فريدة من نوعها في طبيعتها لأنها تأخذ 7-10 أيام لتطوير من خلال خمس مراحل متميزة شكليا. يتم عزل الخلايا غير الناضجة من المرحلة الأولى إلى الرابعة في نخاع العظم parenchyma وتظل غائبة إلى حد كبير من الدورة الدموية الطرفية2،3،4،5. يتم إطلاق كرات الدم الحمراء المصابة بخلايا اللعبة V الناضجة في مجرى الدم ويتم تداولها بحرية ليتم تناولها من قبل البعوض. مرة واحدة داخل midgut البعوض، يتم تنشيط gametocytes، من خلال تغيير في درجة الحرارة والتعرض لبيئة midgut، تتحول إلى الأمشاج الإناث والذكور والبدء في تطوير مراحل البعوض، والتي تبلغ ذروتها مع المراحل المعدية من sporozoites في الغدد اللعابية البعوض6،7.
منذ تراجر وجنسون8 وصف طريقة موحدة لثقافة P. falciparum, وقد تقدمت الدراسات على مراحل الدم اللاجنسي إلى حد كبير. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نظام ثقافة موثوق بها للمراحل الجنسية جعلت من الصعب دراسة P. falciparum gametocytes ، وبيولوجيا انتقال العدوى ومراحل البعوض. في السنوات الأخيرة، وقد نشرت عدة أساليب التي ساعدت المختبرات في إنشاء ثقافات gametocyte9،10،11،12. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا موحدا وموثوقا به لخلايا P. falciparum التي يمكن أن تمثل موردا قيما لمجتمع أبحاث الملاريا. تمكن هذه الطريقة من الإنتاج القوي لخلايا اللعب الناضجة والمعدية التي تؤدي إلى جانب بروتوكول موحد لتغذية البعوض إلى إصابة البعوض موثوقة للغاية. تم إنشاء هذه الطرق للحفاظ على إمدادات غير منقطعة من خلايا اللعبة ، وطفيليات مرحلة البعوض. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف بروتوكول شامل لثقافة الخلايا الشاغة(الشكل 1)،وإعداد مغذيات الأغشية الزجاجية، والعدوى بالبعوض باستخدام مغذيات الأغشية هذه (الشكل 2)،وتشريح البراغيث(الشكل 3)والغدة اللعابية للبعوض(الشكل 4)،وتحديد كمي للعدوى في البعوض بعد تشريح الغدد الوسطى واللعابية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا بنجاح في معهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا لأكثر من 10 سنوات15،16،17،18،19،20،21،22. وقد استخدمت Gametocytes المنتجة باس?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون يشكرون مؤسسة بلومبرغ الخيرية على الدعم المالي لمعهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا(JHMRI). وما كان هذا العمل ممكنا لولا الخبرة التي وفرتها المرافق الأساسية للحشرات والطفيليات في JHMRI.
Materials
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
Referências
- World Health Organization. World Malaria Report. World Health Organization. , (2018).
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E. Sexual Development of Malarial Parasites. Advances in Parasitology. 22, 153-216 (1983).
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B. Cultivation of malarial parasites. Nature. 273 (5664), 621-622 (1978).
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
