트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록
Summary
이 프로토콜은 동시 트랜스 척추 직접 전류 자극을 가진 쥐 요추 모토뉴런의 생체 내 세포 내 기록을 설명합니다. 이 방법을 통해 멤브레인 특성을 측정하고 척수의 무음 또는 음극 편광 전, 도중 및 후에 모토뉴런의 리듬 발사를 기록할 수 있습니다.
Abstract
생체 내에서 척추 운동신경의 세포내 기록은 그대로 척추 네트워크에서 세포의 전기 생리적 특성을 결정하기위한 “금 본위제”를 제공하고 고전적인 체외 또는 세포 외 기록 기술에 비해 상당한 장점을 보유하고 있습니다. 생체 내 세포 내 기록의 장점은 이 방법이 완전히 성숙한 신경계를 가진 성인 동물에서 수행될 수 있고, 따라서 많은 관찰된 생리적 기계장치가 실제 적인 응용 프로그램으로 번역될 수 있다는 것입니다. 이 방법론 논문에서, 우리는 척추 신경 네트워크 내에서 발생하는 편광 과정을 모방 외부적으로 적용 된 일정한 전류 자극과 결합된이 절차를 설명합니다. 트랜스 척추 직접 전류 자극 (tsDCS)은 스포츠뿐만 아니라 다양한 신경 손상 후 재활에 신경 조절 개입으로 점점 더 많이 사용되는 혁신적인 방법입니다. 신경계에 tsDCS의 영향은 제대로 이해 되지 남아 있으며 그것의 행동 뒤에 생리 적 메커니즘은 크게 알 수 없습니다. tsDCS를 세포내 기록과 동시에 적용하면 tsDCS 동작에 대한 이해가 중요한 척추 뉴런 네트워크의 편광에 대응하여 모토뉴런 막 특성및 리듬 발사특성의 변화를 직접 관찰할 수 있습니다. 더욱이, 제시된 프로토콜이 내측 근육 및 그 기능(굴곡 대 엑스텐서)과 생리적 유형(fast vs slow)에 대하여 모토뉴런의 식별을 포함할 때, 이는 편광에 의해 다르게 영향을 받는 척수 회로의 식별된 구성 요소에 대한 tsDCS의 영향을 선택적으로 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 제시된 절차는 결과의 준비 안정성 및 재현성을 달성하는 데 필요한 단계에 중점을 두고 세포 내 기록 및 자극을 위한 외과 준비에 중점을 둡니다. 무음 또는 음극 tsDCS 응용 프로그램의 방법론의 세부 사항은 실용적이고 안전 문제에주의를 기울이면서 논의됩니다.
Introduction
트랜스-척추 직접 전류 자극(tsDCS)은 건강과,질병1,2,23에서척추 회로 흥분성을 수정하는 강력한 방법으로 인정을 받고 있다. 이 기법에서, 일정한 전류는 선택된 척추 세그먼트 위에 위치한 활성 전극 사이에 전달되며, 기준 전극은 통풍구 또는 더 rostrally4에위치한다. 여러 연구는 이미 tsDCS가 신경병증 통증5,경련6,척수 손상7 또는 재활을 용이하게하기 위해 특정 병리학 적 상태를 관리하는 데 사용될 수 있음을 확인했다8. 연구원은 tsDCS가 세포막을 가로 질러 세포내 및 세포 외 공간 사이 이온 분포에 있는 변경을 불러 일으킨다는 것을 건의하고, 이것은 현재방향에따라서 신경 활동을 촉진하거나 억제할 수 있습니다9,10,,11. 그러나, 최근까지, 모토 뉴런에 이 영향의 직접적인 확인이 부족했다.
여기서, 우리는 척추 신경 망의 무음 또는 음극 양극화에 대응하여 모토뉴런 막및 발사 특성의 변화를 관찰하기 위해, tsDCS의 동시 적용과 함께 마취 쥐에서 요추 척추 운동신경으로부터 전기 전위의 생체 내 세포 내 기록을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 세포 내 기록은 이전에 사용 된 세포 외 기술9,12에사용할 수없는 뉴런 특성의 조사의 여러영역을엽니 다. 예를 들어, tsDCS에 의해 유도된 직접 전류 흐름에 대한 모토뉴런 멤브레인 전압 반응을 정밀하게 측정하거나, 스파이크 생성을 위한 전압 임계값을 표시하거나, 동작 잠재적 파라미터를 분석할 수 있다. 더욱이, 이 기술은 입력 저항과 같은 모토뉴런 수동 막 특성을 결정하고, 세포내 자극 전류와 모토뉴런의 리듬 발사 빈도 사이의 관계를 관찰할 수 있게 한다. 기능적으로 확인된 신경(즉, 굴곡 또는 엑스텐서에 efferents을 제공하는 신경)의 자극에 기초하여 기록된 motoneuron의 항드로믹 식별은 편광이 성숙한 척추 뉴런 시스템의 개별 요소에 다르게 영향을 미치는지 여부를 테스트할 수 있는 기회를 제공하는 내부 모터 유닛(fast vs slow)의 유형을 추가로 식별할 수 있게 해줍니다. 기록의 안정성과 신뢰성에 대한 광범위한 수술과 높은 요구 사항으로 인해이 기술은 매우 도전적이지만 하나의 motoneuron의 전기 생리적 특성에 대한 직접적이고 장기적인 평가를 허용합니다 : 급성 행동과 지속적인효과(13)를결정하는 데 중요한 tsDCS의 적용 전, 도중 및 후. motoneuron직접 외경 근육섬유를 활성화 하 고 근육 수축및 개발 된 힘(15)의피드백 제어에 참여 하고,16 모터 단위 또는 근육 수축 특성에 tsDCS의 관찰 된 영향 motoneuron 흥분 성 또는 발사 특성의 변조에 연결 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
올바르게 수행되는 경우, 설명된 프로토콜의 수술 부분은 약 3시간 이내에 완료되어야 한다. 하나는 수술 중 동물의 안정적인 생리 적 상태를 유지에 특히주의해야한다, 특히 체온과 마취의 깊이. 명백한 윤리적 고려 사항 외에도 적절한 마취가 부족하면 신경 해부 또는 라미네절제술 중 과도한 사지 운동이 발생할 수 있으며 준비 또는 조기 실험 종료에 손상을 초래할 수 있습니다. 척수를 미세 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 센터 보조금 번호에 의해 지원되었다 2017/25/ B / NZ7/00373. 저자는 한나 Drzymała-Celichowska와 Włodzimierz Mrówczyinski의 작품을 인식하고 싶습니다, 둘 다 이 논문에 제시된 결과의 데이터 수집 및 분석에 기여했습니다.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
Referências
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