뇌졸중은 최소한의 치료 옵션과 잃어버린 뇌 조직을 재생하기위한 현재 임상 치료와 글로벌 문제입니다. 여기에서 우리는 설치류의 모터 피질에 정확한 광혈전 뇌졸중을 만들고 뇌졸중 후 조직 재생에 미치는 영향을 연구하기 위해 하이드로 겔 생체 재료의 후속 주입을 만드는 방법을 설명합니다.
뇌졸중은 장애의 주요 원인과 미국에서 다섯 번째 주요 사망 원인입니다. 모든 뇌졸중의 약 87%는 허혈성 뇌졸중이며 뇌에 혈액을 공급하는 혈관의 갑작스런 막힘으로 정의됩니다. 막힘의 분 안에, 세포는 정지하기 시작하고 돌이킬 수 없는 조직 손상을 초래합니다. 현재 치료 치료는 혈전 제거 또는 용해에 초점을 맞추어 재관류를 허용하고 더 심각한 뇌 손상을 예방합니다. 일시적인 뇌 가소성은 시간이 지남에 따라 손상된 조직의 일부를 구출 할 수 있지만, 환자의 상당한 분수는 결코 해결되지 않을 신경 적자로 남아 있습니다. 뇌졸중으로 인한 신경 학적 적자를 치료하는 치료 옵션의 부족이있다, 이 증가하는 환자 인구를 치료하는 새로운 전략을 개발하는 필요성을 강조. 주사용 생체 재료는 현재 뇌 가소성을 향상시키고 활성 제또는 줄기 세포의 전달을 통해 내인성 수리를 개선하도록 설계되고 있습니다. 이러한 접근법을 테스트하는 한 가지 방법은 설치류 스트로크 모델을 활용하고, 생체 물질을 스트로크 코어에 주입하고, 수리를 평가하는 것입니다. 뇌졸중 코어의 정확한 위치를 아는 것은 뇌졸중 후 정확한 치료에 필수적이므로 예측 가능한 뇌졸중 위치를 초래하는 뇌졸중 모델은 주입 전에 이미징의 필요성을 피하는 것이 바람직하다. 다음 프로토콜은 광혈전 뇌졸중을 유도하는 방법, 제어되고 정확한 방식으로 하이드로겔을 주입하는 방법, 생물 물질을 손상시키면서 뇌를 추출하고 저온절하는 방법을 다룰 것입니다. 또한, 이러한 동일한 하이드로겔 물질이 줄기 세포의 공동 전달에 어떻게 사용될 수 있는지 강조할 것입니다. 이 프로토콜은 뇌졸중 코어내로 다른 주사용 생체 물질을 사용하는 것으로 일반화될 수 있다.
뇌졸중은 장애의 주요 원인이며 미국에서 다섯 번째로 주요 사망원인입니다 1. 모든 뇌졸중의 약 87%는 허혈성이며 나머지 13%의 대다수는 출혈2입니다. 허혈성 뇌졸중은 주변 조직에 동맥에서 혈류의 막힘으로 정의됩니다. 이 폐색은 수시로 살아남는 환자에 있는 영원한 무력으로 이끌어 내는 산소 부족 그리고 후속 괴사 귀착됩니다. 뇌졸중3의사망률이 감소했지만, 2030년까지 보급은340만명으로 증가할 것으로 예상된다. 장애인 생존자의 증가와 그에 따른 경제적 부담은 신경 수리 메커니즘에 초점을 맞춘 뇌졸중 연구를 위한 추진으로 이어졌습니다. 뇌졸중 다음에 는 괴사 영역이 팽창하는 것을 방지하는 흉터의 형성으로 이어지는 염증 성 기간이 있습니다. 괴사 코어를 둘러싼 지역은 “peri-farct”라고 하며 혈관 신생, 신경 발생 및 축산 발아증가를 포함하는 이 지역의 가소성이 동물 모델과 인간5에서관찰된 회복에 직접 연결된다는 강력한 증거가 있다. 뇌졸중 후 복잡한 상호 작용을 적절하게 복제 할 수있는 체외 모델이 없기 때문에 동물 모델은 뇌졸중 연구에 필수적입니다.
허혈성 스트로크를 생성하는 데 사용할 수있는 생체 내 모델이 몇 가지 있습니다. 마우스에 사용되는 가장 일반적인 모델 중 하나는 말단 또는 근위 (동맥 내 필라멘트를 통해) 폐색을 통해 중간 뇌동맥 폐색, 또는 MCAo입니다. 필라멘트 MCAo (fMCAo)라고도 하는 근위 모델은 일반적으로 대뇌 반구의 5 %에서 50 %까지 포괄하는 큰 허혈성 뇌졸중을 초래하며 요인6의수에 의존합니다. 이러한 모델에서 봉합사 또는 필라멘트는 내부 경동맥에서 중간 뇌동맥(MCA)의 기저부로 발전하여 특정 기간 동안 제자리에 보관된다. 임시 또는 영구로 만들 수 있는 폐색을 위한 이 방법은, 줄무늬에 중심이 되는 광원을 생성하고, 피질6을지나치게 관련시킬 수도 있고 관련되지 않을 수도 있다. 결과 뇌졸중 크기는 매우 가변적이며 레이저 도플러와 같은 이미징 기술은 각 마우스에서 절차의 효과를 확인하는 데 필요합니다. 30분 이상 지속되는 동맥 내 또는 발내 필라멘트 폐색은 크기 범위의 더 큰 끝에서 스트로크를 생성합니다. 일부 조사관은 상당한 실험 초점과 실험실 검증7을필요로하는 짧은 필라멘트 폐색 시간에 초점을 맞추고있다. 마우스에 있는 필라멘트 MCAo 모형은 인간 적인 치기 케이스에서 보인 것과 같이 세포 죽음, 허혈성 진행 및 peri-farct 영역의 형성의 유사한 단계를 따릅니다; 그러나, 더 큰 치기는 악성 뇌 경색의 질병 상태를 더 가깝게 닮은, 덜 일반적이다, 덜 치료 인간 뇌졸중6. 한편, 말단 MCA 폐색은 더 관련된 수술및 craniectomy를 요구합니다. 이 모델에서, 뇌의 표면을 따라 실행되는 MCA의 말단 부분은 봉합사 넥타이 또는 소작으로 직접 가려져 있습니다. 기술의 일부 변형에서, 경동맥은 일방적또는 일시적으로 양측으로 가려져 있다. 말단 MCAo의 장점은 필라멘트 모델보다 크기가 덜 가변적인 피질 기반 스트로크를 생성한다는 것입니다. 그러나, 해단 모델은 fMCAo6의관심사인 외부 경동맥(ECA)의 질부로 인해 더 열악한 행동 출력을 생성한다.
덜 침습적 인 것으로 알려진 대체 뇌졸중 모델은 광혈전증 (PT) 모델입니다. PT 모델은 허혈의 잘 정의된 위치를 초래하고 높은 생존율8과연관된다. 이 기술은 빛 또는 레이저9로원하는 조직을 조사하기만 하면 인트라바스내 광 산화를 허용하는 인트라바스트(intraitone)에 주입된 감광성 염료에 의존한다. 자궁내막시, 내피 손상을 유발하는 산소 라디칼이 형성되어 조사부위8,9에서혈소판 응집 및 응고 형성을 활성화한다. 뇌졸중 크기와 위치를 엄격하게 제어할 뿐만 아니라 PT 모델의 높은 재현성은 생체 재료 연구에 이상적입니다. 정밀도는 레이저 및 스테레오탁스 좌표를 사용하여 가능하지만, 이 모델이 몇 가지 연구에 적합하지 않을 수 있다는 몇 가지 단점이 있습니다. fMCAo 모델과 달리 PT 스트로크 모델은 레퍼퍼프할 수 없습니다. 따라서, 재퍼퓨전 또는 레퍼퓨전 다음 메커니즘에 따른 손상에 특정한 신경보호제 조사를 위한 물질은 여기에서 유용하지 않을 것이다8. 또한 PT 모델의 미세 혈관 모욕으로 인해 상대적으로 작은 허혈성 음벌브라가 보입니다. 대신, 국소 혈관부종은 인간 뇌졸중에 특이하지 않은 것으로 발생하며, 이 모델은 peri-farct 영역6,8에초점을 맞춘 전임상 약물 연구에 바람직하지 않다.
뇌졸중의 생물 물질 전략의 전반적인 목표는 생리 활성 에이전트를 제공하거나 뇌 조직 성장을위한 대리 세포 외 매트릭스 역할을하는 것입니다. 우리가 우리의 방법을 사용하여 탐구할 한 가지 전략은 많은 현재 세포 치료가10전달되는peri-infarct 조직과 는 반대로, 스트로크 코어로 직접 하이드로겔을 전달하는 것입니다. 이 접근법에 대한 근거는 코어에서 발견되는 괴사 조직으로의 전달이 주변의 건강하거나 회복 조직을 방해하지 않을 것이라는 것입니다. 우리는 생물 물질 에 포함 된 임의의 활성 제의 확산은 코어에서 peri-farct에 도달 할 수있을 것입니다 가정, 우리는 하이드로 겔 생체 재료의 전달이 신경교 흉터(11)의두께를 감소 발견하기 때문에 특히. 이것은 peri-farct 지역이 치기 후에 신경 가소성을 전시하기 위하여 표시되었기 때문에 중요합니다, 매력적인 표적으로 만드는. 더욱이, 뇌졸중 코어에 대리 매트릭스의 전달은 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 혈관신생12 또는신경유발성 13인자를 로드할 수 있으며, 전달을 위한 세포(14). 세포 전달은 전달 중에 존재하는 가혹한 주입력 및 현지 환경으로부터 세포를 보호하고 분화 및이식(15)을장려하기 때문에 매트릭스를 사용하여 크게 향상된다.
이러한 주 사용 치료 생체 재료는 뇌졸중 응용 프로그램에서 임상 관련성이 있다, 현재 뇌졸중 후 신경 복구를 자극 하는 의료 치료. 복구에 관여하는 근본적인 신경 회로는 뇌졸중 코어16에인접한 뇌 조직에 있으며 뇌졸중 코어 자체는 실행 가능한 신경 조직이 없습니다. 괴사 뇌졸중 코어에 생체 물질을 전달하는 것은 이전에 언급 된 여러 메커니즘을 통해 인접 조직을 재생 프로세스로 자극 할 수있는 잠재력을 가지고 있을 것으로 예상됩니다( 성장 인자13의창고 방출, 조직 성장 의 자극 및 뇌 조직 개발의 촉진11,12,면역 반응의 변경 17, 줄기 세포 유래 치료제의 전달14, 18. 그러나 이러한 응용 프로그램의 가능성을 효과적으로 연구하기 위해서는 뇌졸중을 유도하고 생체 재료를 주입하는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. PT 스트로크 모델은 스트로크의 방향과 위치를 정밀하게 제어하는 기술을 사용합니다. 스테레오탁틱 장치에 부착된 레이저는 방향을 안내하고, 스테레오택시 장치에 부착된 펌프는 추가 형태의 이미징 없이 재료의 사출 속도를 제어합니다. 따라서, 우리는 마우스의 모터 피질에서 PT 뇌졸중을 수행하고 뇌졸중 코어에 생체 물질을 주입하는 방법을 설명하기로 결정했습니다. 여기서, 우리는 추가된 세포 또는 성장 인자가 없는 주입을 위한 생물재료로 미세다공성 안구 입자(MAP) 하이드로겔을 사용합니다. 또한, 우리는 성공적으로 그대로 생물 재료로 뇌를 검색하는 방법을 설명하고, 우리는 생체 재료의 주입없이 뇌졸중 결과를 분석하는 데 사용되는 면역 화학 분석에 대해 논의.
여기서 우리는 쉽게 재현 할 수있는, 최소 침습, 영구 뇌졸중 모델을 설명하고 뇌졸중 후 5 일 동안 광원에 생체 물질을 주입하는 방법을 설명합니다. 포토thrombotic 염료 로즈 벵골과 스테레오 탁스 장치에 연결된 520 nm 콜라주 레이저의 사용은 우리에게 향상된 정밀도로 마우스의 모터 피질에 스트로크를 배치 할 수있는 기능을 제공합니다. 뇌졸중 후 5일 후, 경색의 위치는 조사의 중심에 눈으로 볼…
The authors have nothing to disclose.
우리는 건강의 국가 학회 및 자금 조달을 위한 신경 장애 및 치기의 국가 학회 (R01NS079691)를 인정하고 싶습니다.
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |