Summary
Målet med detta protokoll är att tillämpa ett optimerat vävnadsdisociationsprotokoll på en musmodell av ryggmärgsskada och validera metoden för encellsanalys genom flödescytometri.
Abstract
Vi beskriver genomförandet av ryggmärgsskada hos möss för att framkalla detrusor-sfinkter dyssynergi, en funktionell urinblåsa utlopp obstruktion och efterföljande urinblåsan väggen ombyggnad. För att underlätta bedömningen av urinväggens cellulära sammansättning hos icke-skadade kontroll- och ryggmärgsskadade möss utvecklade vi ett optimerat dissociationsprotokoll som stöder hög cell livskraft och möjliggör detektion av diskreta subpopulationer genom flödescytometri.
Ryggmärgsskada skapas genom fullständig transection av bröst ryggmärgen. Vid tidpunkten för vävnadsskörden perfunderas djuret med fosfatbuffrad saltlösning under djupbedövning och blåsor skördas i Tyrodes buffert. Vävnader mals före inkubation i matsmältningsbuffert som har optimerats baserat på kollageninnehållet i musblåsan som bestäms genom förhör av offentligt tillgängliga genuttrycksdatabaser. Efter generering av en enda cell suspension analyseras material av flöde cytometri för bedömning av cell livskraft, cell nummer och specifika subpopulationer. Vi visar att metoden ger cellpopulationer med större än 90% livskraft och robust representation av celler av mesenchymalt och epitelialt ursprung. Denna metod kommer att möjliggöra noggrann analys nedströms av diskreta celltyper i musblåsan och potentiellt andra organ.
Introduction
Perturbations av normala urinblåsan funktion kan leda till minskad livskvalitet för många individer. För att få en bättre förståelse för hur skada eller sjukdom spårar ur normal blåsfunktion är det viktigt att undersöka det normala biologiska tillståndet hos celler i urinblåsan och hur de förändras under experimentell stör. Hittills har dock de specifika cellpopulationer som bor i urinblåsan, och hur de förändras med skada, karaktäriserats ofullständigt.
Encellsprofileringsmetoder som flödescytometri eller RNA-sekvensering med en cell (scRNA-seq) har potential att kasta ljus över specifika celltyper i urinblåsan. För att dessa metoder ska vara informativ vävnad måste dock smältas på ett sätt som inte påverkar livskraft, genuttryck och representativa cellpopulationsprocentsatser för den skördade vävnaden. Protokoll som använder enzymatisk disaggregering kan påverka ytmarköruttryck genom urskillningslös proteasaktivitet1, vilket påverkar cellidentifiering genom flödescytometri, medan själva dissociationsprocessen kan leda till induktion av omedelbara tidiga gener, som nyligen beskrevs av Van den Brink och kollegor2. Författarna visade att även om den dissociation-drabbade subpopulationen var liten, det kunde utlösa en stark förorenande signal i bulk uttryck studier på grund av de höga uttryck nivåer av omedelbara tidiga gener. Dessutom upptäckte varaktigheten av det berörda dissociationsprotokollet massuttrycksnivåer av gener som visat sig vara unika för vissa subpopulationer. Således kan enskilda celldatamängder som genereras utan att ta hänsyn till effekten av dissociationsprotokollet ge genuttrycksförändringar som härrör från dissociationsmetoden, i motsats till underliggande biologi. Dessa observationer tyder på att publicerade encelliga transkriptomik data bör tolkas med försiktighet, och att resultaten bör valideras med oberoende metoder.
Även om hårda och långa dissociationsmetoder kan förändra genuttrycket icellerna 2; effektiv isolering av celler är avgörande för att få korrekt representation av de celltyper som finns. Eftersom urinblåsan är ett komplext organ som består av flera celltyper, kan vissa populationer som urothelial eller stromal celler vara relativt underrepresenterade medan andra celltyper som fibroblaster finns inom extracellulär matris och kan vara utmanande att isolera. Dissociation blir ännu mer utmanande om urinblåsan har genomgått betydande ombyggnad och fibros som den som observerats vid ryggmärgsskada3,4 eller urinblåsans utloppsobstruktion5,6.
Här beskriver vi en optimerad vävnad dissociation metod för nedströms encellsanalys i ryggmärgen skadade musblåsan. Med hjälp av flödescytometri jämförde vi fyra enzymatiska matsmältningsprotokoll för deras förmåga att ge en enda cell suspension, stödja cellens livskraft och upprätthålla rätt andel av cellpopulationer. Baserat på denna analys drar vi slutsatsen att minimering av celldöd, cellaggregat, icke-cellulära nukleinsyror och potentiella hämmare av nedströmsanalys är avgörande för att uppnå data av hög kvalitet.
Protocol
Försöken utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid De nationella hälsoinstituten. Alla experiment godkändes av Animal Care and Use Committee of Boston Children's Hospital.
OBS: Möss var inrymda i en AAALAC-ackrediterad djuranläggning med ad libitum tillgång till mat och vatten. Honmöss vid 8\u201212 veckors ålder användes för dessa experiment. Med tanke på skadans art gavs ytterligare näringsberikning till möss för att säkerställa deras välbefinnande.
1. Låg-bröst ryggmärg transection hos möss
- Förberedelse före ryggmärgstransection
OBS: De kirurgiska instrument som krävs för detta förfarande är mikrodesekerande fjädersax, mikrodesekerande tång, mikroutsutgivande nåldrivrutin, hemostater och 7-0 polyglactin 910 suturer. Andra kirurgiska förnödenheter som krävs är kirurgiska draperier, sterila lakan för kirurgiskt fält, gasvävssvampar, bomullsspetsapplikatorer och 1 ml sprutor med 25 G nålar.- Autoklavera de kirurgiska instrumenten och förnödenheterna före operationen.
- Rengör operationsområdet och värmekuddarna med alkoholservetter. Den ena värmedynan kommer att användas under operationen och den andra under den omedelbara postoperativa perioden för att bibehålla djurets kroppstemperatur tills den återfår full aktivitet.
- Använd förstoring av luppar (2,5x eller mer) för att utföra det kirurgiska ingreppet.
- Slå på värmedynorna, ljuskällan och glasplädret så att de är klara att användas under proceduren.
- Öppna operationsdraperierna och instrumenten. Använd sterila handskar för att drapera operationsfältet och placera instrumenten i operationsområdet.
- Beredning av djuren
- Ta mössen till procedurrummet och ta också med en ren bur för ryggmärgsskadade möss.
- Administrera anestesi genom att placera musen i induktionskammaren med isofluranflöde inställt på 3,0%, syreflödet vid 1 L/min och sug vid 20 mmHg tills det inte finns något tass-nyprespons.
- Väg omedelbart djuret och placera sedan djuret i benägen position på värmeplattan.
- Placera bedövningskonen tätt över musens näsa, byt gasflödet från induktionskammaren till noskonen och ställ in isofluranflödet på 2 % och syreflödet till 1 L/min.
- Bekräfta att djuret är tillräckligt bedövat med frånvaron av svar på tass-nypa. Tejpa fast djurbenen på värmeplattan. Placera en rullad bit gasvävsvamp under nedre bröstet för att höja och böja upp de nedre bröstkotorna.
- Applicera oftalmiskt smörjmedel på båda ögonen. Administrera smärtstillande läkemedel (Meloxicam, 10 mg/kg, subkutant) och antibiotikum (Enrofloxacin, 5 mg/kg, subkutant).
OBS: Slutanvändare bör använda smärtstillande läkemedel och antibiotika som rekommenderas av deras lokala djurvårds- och användningskommitté. - Palpate den mest framträdande spinous processen i bröstryggen som vanligtvis motsvarar T13 spinous process7. Raka ett längsgående rektangelområde på baksidan av musen från nedre nacken till strax under den mest framträdande spinnprocessen (T13) och i 1 cm på varje sida av mittlinjen.
- Kirurgiskt ingrepp
- Förbered det rakade området med 10% povidone jodlösning och 70% etanol tre gånger alternativt på ett cirkulärt sätt från snittplatsen som arbetar utåt och täck sedan djuret med steril 4 x 4 gasvävsvamp med ett fönster i mitten som överbetonar operationsfältet.
- Gör 1,5 cm snitt i mitten av ryggen med fin sax som slutar vid den mest framträdande spinous processen (T13). Snittet bör inkludera huden och ytlig fascia. Att använda sax separerar huden och ytlig fascia på vardera sidan för att exponera spinusprocesserna och de omgivande paraspinous musklerna.
- Med hjälp av skarp och trubbig dissekering separerar musklerna från spinous processerna och laminae av T9, T10 och T11 ryggkotor.
- Dela kraftigt de interspinous ligamenten mellan T9 och T10 och mellan T10 och T11 med hjälp av fin sax och sedan punktskatt den spinous processen av T10 och noggrant utföra T10 laminectomy bilateralt för att exponera ryggmärgen. Se till att laminaen är helt struken.
- Transsekera ryggmärgen med fin sax. Minimal blödning uppstår vanligtvis vid denna tidpunkt på grund av transection av ryggmärgskärlen. Komprimera blödningsområdet med en steril bomullsspetsad applikator för att uppnå hemostas. Efter att ha bekräftat fullständig hemostas, stäng huden med 7-0 polyglactin 910 kontinuerliga suturer.
- Administrera 1 ml saltlösning subkutant för att förhindra postoperativ uttorkning.
- Postoperativ vård
- Placera djuret på en värmedyna tills full återhämtning har inträffat och överför sedan till en bur för endast ryggmärgsskadade möss.
- Postoperativ vård inkluderar observation och vägning av djuren dagligen och övervakning av snittplatsen för tecken på infektion i upp till 7 dagar. Administrera 1 ml saltlösning, smärtstillande medel (meloxicam 10 mg/kg) och antibiotika (enrofloxacin 5 mg/kg) alla subkutant dagligen i 3 dagar.
OBS: Slutanvändare bör använda smärtstillande läkemedel och antibiotika som rekommenderas av deras lokala djurvårds- och användningskommitté. - Utför manuellt blåsuttryck (Credé-manöver) var 12: e timme tills djuret kan urinera på egen hand (vanligtvis om 10 till 14 dagar). Håll djuret med ena handen och massera underlivet med den andra handen, känn sedan och komprimera försiktigt den distended urinblåsan med pekfingret och tummen. Mild övergående komprimering bör alternera med avkoppling. Efter manuellt uttryck, tvätta underlivet med kranvatten och torka försiktigt med pappershandduk utan överdriven gnuggning.
OBS: En liten storlek på urinblåsan före början av uttrycket och våtning av underlivet med urin är indikationer på att djuret har fått förmågan att ogiltigförklara på egen hand. - För att minimera viktminskning, ge näringsberikning till möss i form av näringsrik gel och andra näringsrika godsaker (baconmjukhet, fruktknäckor och vegobett) placerade på burgolvet för enkel åtkomst OBS: I denna studie perfunderades möss och blåsor anskaffades vid 8 veckor efter SCI.
- Postoperativa komplikationer
- Minimera risken för sprängning av urinblåsan på grund av övernitiska manuella urinblåsan uttryck genom att inte helt uttrycka urinblåsan.
- Förhindra excoriation av perineal huden från kontinuerlig exponering för urin dribbling från inkompetent sfinkter genom tvättning av perineal regionen med kranvatten. Minimera inflammation genom applicering av trippelantibiotisk salva.
OBS: Uretral obstruktion på grund av blodpropp under perioden av övergående hematuri eller från spermakoagulum på grund av retrograd utlösning hos hanmöss kan uppstå efter ryggmärgsskada. Fullständig urethral obstruktion hos manliga möss kulminerar ofta i urinblåsan sprängning och död. Enligt vår erfarenhet var frekvensen av urethral obstruktion hos manliga möss som ledde till döden 10%.
2. Perfusion och vävnadsupphandling
OBS: För nedströmsanalyser av vissa celltyper såsom immunceller i perifera vävnader är det fördelaktigt att ta bort blod genom perfusion vid tidpunkten för vävnadsskörden, enligt beskrivningen nedan.
- Administrera anestesi som nämnts i det kirurgiska ingreppet (steg 2.2) och bekräfta att djuret är tillräckligt sövt utan forepaw-pinch svar (djuret är paraplegiskt, därför har hindlimbs minskat känsla och hindpaw-pinch svar blir irrelevant).
- Placera djuret i supinläge och svabba buken och bröstet med 70% etanol för att blöta pälsen för att förhindra att den kommer in i operationsplatsen.
- Utför en midline laparotomy från bäckenet till membranet. Skär bort membranet från revbenen.
OBS: Efter detta steg är hastighet viktigt eftersom brösttrycksskillnaden inte längre finns och lungorna inte kan blåsa upp, så djuret börjar kvävas. - Skär bröstkorgen öppen längs revbenen på vänster och höger sida efter benbroskgränsen på en linje parallellt med bröstbenet, med början vid membranet och fortsätt så långt som till det första revbenet.
- Placera hela den främre bröstväggen över djurets huvud och fixera den i detta läge med hjälp av handduksklämmor. Skär inte av den främre bröstväggen eftersom detta kommer att orsaka allvarlig blödning från de två inre bröstartärerna.
- Skär bort pericardiumet med fin sax.
- Anslut en 23 G nål till perfusionsapparaten, sätt sedan in den i vänster ventrikel och långsamt i aortan, var försiktig så att du inte punkterar den.
OBS: Perfusionsapparaten består av en perfusionspump och 50 ml spruta ansluten till intravenösa slangar. - Starta perfusionen och gör snabbt ett litet snitt med spetsen av fin sax i rätt atrium för dränering. Var försiktig så att du inte inför luftbubblor under vätskeinfusion.
- Utför perfusion med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som körs vid 15 ml/min. Perfusionen är klar när dräneringen är klar och lättare leverfärg uppnås (figur 1).
OBS: Den genomsnittliga tiden för perfusion var 3,5–4 min. Otillräcklig perfusion manifesteras som långsam progression av blanchering av vävnader och beror vanligtvis på felaktig positionering av nålen i vänster ventrikel. Att justera nålen och förlänga perfusionstiden i 1 till 2 minuter kommer att säkerställa tillräcklig perfusion av vävnader. - Avbryt perfusionen och dissekera urinblåsan fri från kärl pedicles och urinrör och placera den i ett mikrocentrifugrör som innehåller iskallt Tyrodes lösning.
3. Matsmältning av urinblåsan i kontroll och ryggmärgsskadade möss
OBS: För att formulera en effektiv matsmältningsblandning som är skräddarsydd för mus urinblåsan försökte vi justera enheten av enzymer som används för att bryta ner de dominerande extracellulära matriskomponenterna såsom kollagener och hyaluronsyra. Därför använde vi offentligt tillgängliga RNA-sekvenseringsdata som genererats av Mouse ENCODE-projektet (BioProject: PRJNA66167) för att extrahera läsningar per kilobas per miljon (RPKM) och Tabula Muris8 för bedömning av rumsliga uttryck inom urinblåsan. Kollagener 1, 3 och 6 var de tre mest uttryckta generna bland 42 olika kollagener (Figur 2A). Uttrycket av dessa kollagener och hyaluronan syntas 1 (Has1) observerades mestadels i muskelceller och fibroblaster i urinblåsan väggen (Figur 2B).
- Förberedelse av buffertar och lösningar
- Bered natriumtyroldlösning enligt tabell 1 i en ren 500 ml-flaska. Tillsätt 300 ml ddH2O. Lösningen är sur efter beredning. Justera pH till 7,4 med NaOH. Ta volym till 500 ml med dubbeldestillerad H2O, sedan alikvot och förvara vid -20 °C.
OBS: Denna buffert upprätthåller pH- och osmotisk balans i rötningsbufferten och förser cellerna med vatten och väsentliga oorganiska joner. Den innehåller magnesium, liksom glukos som en energikälla. Kaliumet i lösningen ger skyddande effekter på elektromekanisk aktivitet i den isolerade celllösningen. Pulveriserade salter är hygroskopiska och bör skyddas mot fukt. Hela innehållet i blandningen ska användas omedelbart efter beredningen. Beredning av en koncentrerad saltlösning rekommenderas inte eftersom fällningar kan bildas. Sterilisering med filtrering (0,22 μm filter) kan utföras om cellerna ska odlas efter analys. - Bered enzymatisk matsmältningslösning i ett koniskt rör på 15 ml genom att tillsätta rekommenderade volymer och mängder för varje komponent (tabell 2). Tillsätt natrium tyrodlösning upp till 2,5 ml. Vortex ska lösas upp ordentligt.
OBS: Papain är en sulfhydrylproteas från Carica papaya latex. Papain har bred specificitet och det kommer att bryta ner de flesta proteinsubstrat9. Papain har visat sig vara mindre skadligt och effektivare än andra proteaser i celldisociationsprotokoll10. Vi ger detaljer om de fyra dissociationsprotokollen i tabell 2; vi observerade protokoll avsnitt 3 för att stödja högsta lönsamhet (93%) cellupphängningar som framställs av musblåsan.
- Bered natriumtyroldlösning enligt tabell 1 i en ren 500 ml-flaska. Tillsätt 300 ml ddH2O. Lösningen är sur efter beredning. Justera pH till 7,4 med NaOH. Ta volym till 500 ml med dubbeldestillerad H2O, sedan alikvot och förvara vid -20 °C.
- Dissociation förfarande och förberedelse av cell suspension
- Samla urinblåsan från möss efter perfusion.
- Punktera blåsan för att frigöra innehåll, om det finns något.
- Tillsätt 100 μL tyrods lösning till ett tomt 1,5 ml centrifugeringsrör och tara. Placera blåsan i röret och väg igen för att bestämma en exakt blåsvikt.
- Placera urinblåsan på en 10 cm petriskål på is och tillsätt 100 μL av Tyrodes lösning för malning.
- Använd kirurgisk sax, skär bitar så små som möjligt samtidigt som mincingtiden minimeras till högst 2\u20123 min per blåsa. Om man slår samman blåsvävnad från flera djur, hacka blåsorna på en gång.
- Överför den malda blåsvävnaden med hjälp av en bredborrad rörspets till 2,5 ml rötbuffert för varje blåsa. Justera volymen om flera blåsor slås samman. Inkubera vävnaden i matsmältningslösningen vid 37 °C i en inkubator på en mutterblandare i 40 minuter.
- I slutet av inkubationsperioden, ta bort matsmältningsröret från inkubatorn. Triturat (pipet upp och ner) rötningslösning med en 5 ml pipett i 1 min.
- Centrifug i 10 min vid 350 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml cellavlossningslösning. Placera i en 37 °C inkubator på mutterblandare i 10 min.
- Centrifug i 10 min vid 350 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml RBC lysbuffert (1x). Inkubera i 1 minut.
- Tillsätt 9 ml PBS för att späda ut RBC-bufferten och stoppa RBC-lyset.
- För cellerna genom 70 μm cellsil till 50 ml koniskt rör med kolven från en spruta för att lätt skrapa cellsilen för att säkerställa fullständig cellpassage. Se till att samla in vätskan som passerar genom silen men kan fastna på undersidan av silen.
- Centrifug i 10 min vid 350 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 200 μL cellfärgningsbuffert (PBS med 2% FBS).
- Räkna cellerna.
- Immunolabeling av specifika celler för flödescytometri
OBS: För att upptäcka olika typer av celler i urinblåsan designade vi en flerfärgsflödescytometripanel. För att utföra kompensation och utforma en lämplig gating-strategi inkluderar vi osedd och fluorescens minus en (FMO) kontroller. FMO-kontroller är viktiga för att gate positiv befolkning, särskilt när den positiva fraktionen är dim. Färgningsproceduren är följande.-
Blockera FcγRII/III-receptorer på celler
OBS: Vi rekommenderar att du blockerar ospecificerad bindning av monoklonala antikroppar genom förinkubation av celler med monoklonala anti-Fc receptor antikroppar, eller rekombinant Fc protein.- Tvätta cellerna genom centrifugering vid 350 x g i 5 min vid 4 °C och tillsätt cellfärgningsbuffert.
- Kassera supernatant och blockera FcγRII/III-receptorer på celler för att förhindra icke-specifik antikroppsfärgning genom att tillsätta CD16- och CD32-antikroppar i cellfärgningsbuffert vid utspädning 1:100.
- Inkubera på is i 10 minuter.
OBS: Det finns inget behov av att tvätta cellerna; celler kan färgas direkt efter detta stadium.
-
Färgning för FMOs
OBS: En fluorescens minus en (FMO) kontroll är ett rör av alla fluorokromer som används i experimentet som innehåller alla fluorokromer utom en.- Om man till exempel har 4 olika fluorokromer (A, B C och D + Annexin V och propidiumidoodid (PI)), bered FMO-rören enligt följande. FMO-rör 1: Antikroppar konjugerade med B, C, D-fluorokromer + (Annexin V och PI). FMO-rör 2: Antikroppar konjugerade med A, C, D-fluorokromer + (Annexin V och PI). FMO-rör 3: Antikroppar konjugerade med A, B, C fluorokromer + (Annexin V och PI). FMO-rör 4: Antikroppar konjugerade med A, B, C, D-fluorokromer + (Annexin V). FMO-rör 5: Antikroppar konjugerade med A, B, C, D-fluorokromer + (PI).
- Tänk på arten av den konjugerade fluorokromen för annexin V-antikroppen.
-
Färgning av de blockerade cellerna med önskade antikroppar
- Inkubera blockerade celler med lämpliga masterblandningar av fluorforkonjugerade antikroppar mot önskade proteiner i 20 minuter på is skyddad mot ljus. Kom ihåg att inkludera fmos.
- Tvätta celler med 1 ml cellfärgningsbuffert som tillsätts varje rör och centrifugera sedan igen vid 350 x g i 5 min vid 10 °C.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 200 μL cellfärgbuffert. Håll på is tills fluorescensdata kan förvärvas med hjälp av en flödescytometer.
-
Applicera Annexin V/ PI-fläck.
- Bered en arbetslösning av PI (100 μg/ml) i 1x Annexin-bindande buffert enligt beskrivningen i tillverkarens protokoll för dödcellsapoptossatsen.
- Bestäm celltätheten och notera bufferten och volymen där de lagras.
- Centrifugprover vid 350 x g i 5 min, kassera supernatant- och återanvändbara celler i 1x Annexin-bindande buffert till en densitet av ~1 x 106 celler/ml i en volym av 100 μL.
- Tillsätt FITC-Annexin V (5 μL) och PI arbetslösning (1 μL) till varje prov (100 μL), enligt beskrivningen i tillverkarens protokoll, och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Tillsätt 400 μL 1x Annexin-bindande buffert till proverna, blanda genom inversion och håll på is tills flödescytometrin.
-
Blockera FcγRII/III-receptorer på celler
- FACS-kalibrering
-
Flödescytometri och renhetskontroll
- Starta flödescytometrianalysen genom att mäta de osedda cellerna för att avgränsa cellmorfologin och fluorokromernas tråg.
- Justera sidospridningen (SSC) och den främre scattern (FSC) genom att ändra spänningarna för varje fluorescensparameter. Mät fluorescensutsläppen vid 530 nm (Annexin V) och >575 nm (PI).
- Definiera den negativa populationen under det första decenniet med hjälp av rutnäten på varje prickdiagram. Placera varje FMO-kontroll i cytometern och korrigera spektralöverlappningen tills de negativa och positiva populationens medianvärden är i linje.
- Mät 100 000 händelser. Mät celler färgade med specifika markörer och skapa grindar för cellpopulationer av intresse.
-
Flödescytometri och renhetskontroll
- Dataanalys
- Samla in data från flödescytometern. Öppna programvaran för att visualisera arbetsytan för analys.
- Skapa en arbetsyta
- Importera FCS-filer genom att dra dem till arbetsytan. Filer visas i exempel- och gruppavsnittet på arbetsytan. Dubbelklicka i exempelnamnet för att öppna filen.
- Använd sidospridningsområdet (SSC-A) för y-axeln och det främre punktområdet (FSC-A) för x-axeln (figur 3A). Klicka på ikonen för polygongating.
- Skapa en port runt cellpopulationen av intresse i prickdiagrammarken genom att klicka för att skapa en portnod och fortsätt sedan att klicka runt cellpopulationen tills den är klar. dubbelklicka för att stänga grinden.
- Namnge porten enligt den fångade populationen (t.ex. "Alla celler") och klicka på OK.
OBS: Om du dubbelklickar i porten "Alla celler" öppnas ett nytt diagramfönster som bara visar händelserna i "Alla celler". - Justera y-axeln för det nya punktdiagramt till SSC-H (sidospridningshöjd) genom att klicka i den svarta pilen och markera för att ändra y-axeln.
OBS: Dessa portar för enstaka celler (singlets) och utesluter dubblettar eller större aggregat (figur 3B). Eftersom enstaka celler har proportionell bredd och längd bör de representeras som en population på diagonalen. Celler som faller utanför denna diagonala grind är dubbelgångare eller större aggregat. - Dubbelklicka på porten för att analysera nekrotiska (PI-positiva), tidiga apoptotiska (Annexin V-positiva, PI-negativa) och sena apoptotiska (Annexin V-positiva, PI-negativa) celler(figur 3C).
- Märk x-axeln som Annexin V och y-axeln som PI.
OBS: I vissa fall, där signalintensiteten är låg, kan cellpopulationer verka ha negativa fluorescensvärden, som ett resultat av korrigering för bakgrund. I det här fallet rekommenderas att utföra en bi-exponentiell omvandling. För att göra detta, klicka på T bredvid y-axeln och välj Anpassa axel. I det nya fönstret ändrar du skalan till bi-exponentiell (Biex), lägger till negativa värden på axlarna genom att öka breddbasen och klicka på Använd. Detta kommer att förbättra upplösningen av händelser med låg signalintensitet. - Visa data som en räkningsdiagram. Använd fliken Alternativ precis under x-axeln och välj räknardiagram på menyn.
- Rita en Quat gate på tomten för att definiera 4 diskreta målpopulationer.
- Klicka högst upp i fönstret för att öppna layoutredigeraren genom att klicka i Layoutredigeraren och dra populationer till varje separat område.
- Placera tomter i layoutredigeraren genom att dra och släppa populationer från arbetsytan i layoutredigerarens fönster.
- Visualisera med histogram
- Välj histogram på fliken Alternativ.
- Applicera en grind för att välja Annexin V-positiva celler. Alternativt kan positiva och negativa populationer definieras med hjälp av bisector-verktyget. Exempelavsnittet måste nu visa de olika populationer som har varit form och deras hierarki.
- Om du vill jämföra exempel drar du alla histogram ovanpå varandra. högerklicka på histogrammet och välj Stagger Offsetfrån histogrammet .
- Lägg till statistiska analyser
- Öppna fliken Statistik genom att dubbelklicka på intressepopulationen. Välj den funktion som ska tillämpas och den berörda parametern.
- Upprepa med andra populationer genom att dra Sigma-ikonen till befolkningsnamnet.
- Tillämpa analysen på alla prover genom att välja gatingstrategin från det intresseprov som ska tas och dra in den i den grupp som definieras av intressemarkören, t.ex.
- Skapa grindar i FMO-kontrollproverna och definiera negativa och positiva populationer. Denna gatingstrategi kommer att tillämpas på hela experimentet(figur 3D\u2012F).
OBS: Kontrollera varje prov individuellt för att säkerställa att gating är korrekt och ändra vid behov. - Om celler har färgats med markörantikropp (t.ex. CD45) använd motsvarande FMO och grind i enlighet därmed.
- Om du vill exportera layouten klickar du på | Exportera bild | Välj filformat (t.ex. jpg, pdf).
- Klicka på Skapa tabell om du vill öppna ett fönster med den slutliga versionen av tabellen.
- Exportera tabellen genom att välja | Spara som | Filnamn.
Representative Results
Kirurgiskt ingrepp
Framgången med bröst ryggmärg transection bestäms genom bedömning av ett antal parametrar, varav den mest uppenbara är hindlimb förlamning. Djuret rör sig bara med sina framben och drar sina bakben. Annars är aktivitetsnivåer, inklusive utfodring, grooming och vakenhet vanligtvis normala. Dessutom förlorar djur volitional urinblåsa kontroll vilket resulterar i behovet av manuell urinblåsa uttryck av prövaren var 12 h tills reflex voiding återvänder vid 10 till 14 dagar efter skada. Efter dödshjälp, ytterligare tecken på framgången av skadan avser främst ökningen av urinblåsan-till-kropp viktförhållandet, vägledande för vävnad ombyggnad. Histologisk analys visar hyperplasi inom både urothelial och glatt muskel fack3.
Förberedelse av encellig suspension
Med hjälp av allmänt tillgängliga uttrycksdata fastställdes anrikningen av blåsvävnad för extracellulära matrisproteiner (figur 2) och användes för att informera formuleringen av matsmältningsblandningen. Eftersom kollagener är viktiga komponenter i urinblåsan vägg11,12, först försökte vi bestämma de mest rikliga kollagen i musblåsan med hjälp av RNA profileringsdatauppsättningar som genereras av Mouse ENCODE-projektet13. Vår analys visade att kollagen 1A1, kollagen 3A1, kollagen 1A2 och kollagen 6A1 är de vanligaste kollagentyperna i musblåsan (Figur 2A). Vi använde också Tabula Muris (ett kompendium av encelliga transkriptomdata från mus (Mus musculus))8 för att bestämma mRNA-uttrycksnivån för kollagener 1, 3, 6 och hyaluronan. Data möjliggör direkt och kontrollerad jämförelse av genuttryck i celltyper som delas mellan vävnader. Denna analys visade att uttrycket av dessa extracellulära matriskomponenter är vanligare i mesenchymala celltyper snarare än urothelium (Figur 2B).
Effekt av dissociation på livskraften hos isolerade celler från urinblåsan
Flöde cytometri analys visat att enzymatiska matsmältningen med hjälp av de 4 olika protokollen gav livskraft på 83%, 86%, 93% respektive 90%. Protokoll avsnitt 3 ansågs således vara mest värdefullt för bevarande av cellens livskraft. Vi observerade också att cirka 4 % av cellerna var nekrotiska (PI+/Annexin V-) (figur 4A). Dessa observationer betonar effektiviteten i matsmältningsprotokollet och den efterföljande fördelen på cellens livskraft.
Effekt av ryggmärgsskada på olika populationer av celler i urinblåsan
Vi observerade en betydande ökning av det totala antalet celler i blåsor av SCI-möss jämfört med kontroller. Mönstret för de punktdiagram som erhållits från SCI-blåsor var också något annorlunda i linje med pågående organombyggnad på grund av ryggmärgsskada (Figur 4B: första kolumnen). Jämfört med kontroller uppvisade blåsorna från SCI-djur en signifikant ökning av CD45-positiva celler.
Figur 1: Representativ perfusionsavslutning med ljusare leverfärg. (A) Visar leverfärgen i början av perfusionen. (B) Visar den lättade leverfärgen i slutet av perfusionen. Musen i (A) hade ryggmärg transection två veckor före perfusion vilket resulterar i urinblåsan hypertrofi och dess utskjutning ur bäckenet till skillnad från musen i (B) som inte hade ryggmärgsskada; I detta fall är blåsan liten och dold i bäckenet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Transkriptomiskt uttryck av ecm-komponenter (extracellulär matris) i musblåsan. (A) Stapeldiagram med 43 olika kollagentyper. Uttrycket anges av Reads Per Kilobase of transcript, per miljon kartlagda läsningar (RPKM) (data samlas in från BioProject: PRJNA66167)14. (B) Violindiagram av genuttryck i celltyper som erhållits från mikrofluidisk droppbaserad 3'-end-räkning i en pool av manliga och kvinnliga dissocierade urinblåsaprover (manliga och kvinnliga). Räkningarna var log-normaliserade för varje cell med hjälp av den naturliga logaritmen på 1+ räkningar per miljon ln(CPM+1)8. Ett pseudocount på 1 CPM lades till innan logaritms togs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Gatingstrategi och FMO-kontroller för att fastställa fluorescensspridning. A)Urval av cellpopulation. B)Gating strategi för singlar. c)Gating för nekrotiska och tidiga och sena apoptotiska celler med pi- och annexin V-antikroppar. (D\u2012F) Ett schematiskt punktdiagram med cytometri med flerfärgsflöde (t.ex. antikroppar konjugerade med A, B, C, D-fluorokromer + (Annexin V och PI). Detta visar fluorescensen som sprids i antikroppen med fluorokrom en kanal som visas av FMO-kontrollen jämfört med en osedd kontroll. Orange prickad linje representerar FMO-gatinggräns jämfört med obeknastad gräns i rött. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Flödescytometri av olika celltyper i urinblåsan. a)Annexin V/PI dubbelfärgningsflödesscheman. De olika kombinationerna av enzymer och kemikalier som används för varje protokoll representeras framför motsvarande lönsamhetsdiagram. Dessa data visar att högsta lönsamhet erhölls med protokoll avsnitt 3. B)Representativa histogram som illustrerar intensiteten hos Ly-6A/E (Sca-1) och CD326 (Ep-CAM) som upptäckts i enskilda kanaler. (C) Effekten av SCI på musblåsans cellpopulation. Övre panelen visar resultat av färgning på tre dissocierade blåsor som erhållits från kontroll icke-kirurgiska möss och nedre panelen visar resultaten av färgning på tre djur med SCI. Den första kolumnen är den totala cellpopulationen. Den andra kolumnen visar singlet gating-markeringen. Den tredje kolumnen visar subpopulationen av levande celler som är negativa för B-celler, T-celler och NK-celler. Den fjärde kolumnen visar färgningen för levande celler som är positiva för CD45. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Komponent | Belopp (för 500 ml) | Molaritet |
| Nacl | 4.091 g | 140 mM |
| KCl (kcl) | 0,186 g | 5 mM |
| MgCl2 | 0,0476 g | 1 mM |
| D-Glukos | 0,9 g | 10 mM |
| HEPES (HEPES) | 1,19 g | 10 mM |
Tabell 1: Komponenter för beredning av Tyrodes lösning. De angivna komponenterna är för beredning av 500 ml Tyrodes lösning.
| Komponent | Belopp | Protokoll avsnitt 1 | Protokoll avsnitt 2 | Protokoll avsnitt 3 | Protokoll avsnitt 4 |
| Bsa | 5 mg | Ja | Ja | Ja | Ja |
| CaCl2 | 0,03 mM | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Kollagenas typ I | 132,5 enheter | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Kollagenas typ III | 96,4 enheter | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Kollagenas typ VI | 50 enheter | - | - | Ja | - |
| DNase (DNase) | 10 enheter | Ja | Ja | Ja | - |
| Papain | 115 enheter | - | - | Ja | Ja |
| Pan kollagenas | 50 enheter | - | - | Ja | Ja |
| Hyaluronidase | 10,5 enheter | - | - | Ja | Ja |
| Dispase II | 1,25 enheter | Ja | Ja | - | - |
| Lösning för celldisociation | 1 ml | Ja | - | Ja | - |
| Rekombinant enzym | 1 ml | - | Ja | - | Ja |
Tabell 2: Komponenter för beredning av rötningsbuffert. De angivna komponenterna är till för beredning av 2,5 ml rötningsblandning (1 U katalyserar hydrolysen på 1 μmol per substrat per minut vid 37 °C. Se produktdatabladet för definition av enhet för varje enzym).
Discussion
Mus ryggmärg skada modell beskrivs här ger en reproducerbar metod för att skapa en funktionell urinblåsa utlopp obstruktion på grund av förlust av samordning mellan urinblåsan sammandragning och externa urethral sphincter avkoppling. Detta i sin tur framkallar djupgående ombyggnad av urinblåsan väggen så tidigt som 2 veckor efter skada kännetecknas av expansion av urothelial och smidiga muskel fack. Kritiska steg i genomförandet av SCI-modellen hos gnagare inkluderar (i) rigorös uppmärksamhet på manuella blåsuttryck under den period av spinal chock som följer i 10\u201214 dagar efter skada; ii) Näringsberikning för att minimera viktminskningen. iii) Begränsning av risken för urinsvetsning, särskilt för experiment som sträcker sig längre än återgången till reflexhåla. Begränsningar av modellen inkluderar potentialen för urethral ocklusion hos möss från blodproppar under perioden av övergående hematuri, och dessutom hos hanmöss från spermakoagulum efter retrograd utlösning efter kirurgi.
Vävnad dissociation strategi beskrivs här illustrerar vikten av att överväga strukturella förändringar i vävnader som härrör från experimentella förolämpning, i detta fall betydande vävnad ombyggnad efter SCI som kan påverka nedströms analyser. Med ökningen av encellsanalyser är det viktigt att se till att skillnader som observerats i genuttryck inte bara är ett resultat av dissociation-inducerad oro, men är verkligen representativa för underliggande biologiska förändringar som är relevanta för sjukdomsmodellen. Användningen av offentligt tillgängliga uttrycksdata gjorde det möjligt för oss att ändra formuleringen av matsmältningsbuffertar för att säkerställa effektiv matsmältning av extracellulär matris samtidigt som vi maximerade livskraften. Ytterligare ändringar som kan övervägas i framtida tillämpningar inkluderar tillsats av actinomycin D, för att stoppa transkription av omedelbara tidiga gener som är känsliga för dissociationsprotokollet15.
Pipetting teknik är avgörande när man dissociating vävnad eller överföra celler som redan är i suspension. För att minska fysiska skador på celler från saxkrafter är det viktigt att pipetten försiktigt och långsamt under cellresuspensionen. Det rekommenderas i allmänhet att använda bredborrade pipettspetsar. Om du använder standardspetsar är det särskilt viktigt att pipettcellsupphängningar försiktigt för att undvika savkrafter som annars skulle skada celler. Att använda cellsilar är oundvikligt i detta protokoll, men cellkoncentrationen kan minska med 20% eller mer, åtföljd av en volymförlust på 100 μL eller mer. Vi rekommenderar att cellkoncentrationen bestäms efter påfrestning för att säkerställa ett exakt cellantal.
I flödescytometri ger FMO-kontroller ett mått på bakgrund på grund av avluftning av signal från överlappande utsläppstoppar. De är inte ett mått på ospecificerad antikroppsbindning eller bakgrundsfärgning som kan förekomma när en antikropp ingår i den kanalen. För att ta hänsyn till den ospecificerade antikroppsbindningen måste man inkludera lämpliga isotypkontroller. för bakgrundsfärgningen måste man inkludera negativa kontroller. Sammantaget säkerställer dessa kontroller noggrann mätning av cellpopulationer.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R01 DK077195 till R.M.A, R01 DK104641 till R.M.A och D.R.B). Vi erkänner värdefulla bidrag från Dr. Stuart Orkin vid avdelningen för hematologi/ onkologi, Boston Children's Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School och Dana-Farber Cancer Institute. Vi erkänner också stöd från Kyle Costa i postoperativ vård av möss, Mary Taglienti och Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) för teknisk hjälp och hjälpsamma diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 X Magnifying Loupes | |||
| 7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
| 70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
| Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
| Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
| Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
| APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
| BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
| BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
| CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
| CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
| Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
| Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
| Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
| Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| DNase | Sigma | DN25-1G | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
| Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
| FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
| Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
| McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
| Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
| PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
| PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
| Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
| Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
| TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
| Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |
References
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- van den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Seth, A., et al. The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility. BMC Urology. 13, 24 (2013).
- Doyle, C., et al. Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway. Scientific Reports. 7, 44416 (2017).
- Gheinani, A. H., et al. Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction. JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).
- Gheinani, A. H., et al. Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. Journal of Visualized Experiments. (78), e50111 (2013).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases. Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).
- Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice. MethodsX. 2, 39-46 (2015).
- Aitken, K. J., Bagli, D. J. The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease. Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).
- Aitken, K. J., Bagli, D. J. The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications. Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).
- The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
