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Pesquisa do Câncer

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

Published: July 17, 2020
doi:
10.3791/61457
, , , , ,
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center,Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。

Abstract

PTPN11プロトオンコジーンによってコードされるSrc相同症2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)駆動細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。また、SHP2は、BおよびT細胞活性化を阻害する免疫チェックポイント受容体によってリクルートされる。異常なSHP2機能は、多くの癌の発達、進行、転移に関与している。実際、低分子SHP2阻害剤は最近、いくつかの発癌性Ras突然変異を有する腫瘍を含むRas/Raf/ERK経路活性化を伴う固形腫瘍の治療のための臨床試験に入った。しかし、現在のクラスのSHP2阻害剤は、白血病で頻繁に発生するSHP2発がん型変異体に対して有効ではなく、発癌性SHP2を標的とする特定の低分子の開発が現在の研究の対象となっている。SHP2のような細胞質タンパク質を含むほとんどの創薬キャンペーンの共通の問題は、化学発見を促進する主要なアッセイは、多くの場合、候補化合物の細胞標的関与を報告しないインビトロアッセイであるということです。細胞ターゲットエンゲージメントを測定するためのプラットフォームを提供するために、野生型と変異型の両方のSHP2細胞熱シフトアッセイを開発しました。これらのアッセイは、細胞内のSHP2阻害剤の標的関与を確実に検出する。ここでは、SHP2阻害剤の評価と特性評価のための貴重なツールを提供するこのアッセイの包括的なプロトコルを提供します。

Introduction

チロシンリン酸化は、細胞11,2におけるシグナル伝達において重要な役割を果たす。この翻訳後修飾は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)によって触媒され、タンパク質チロシンホスファターゼ(Ptps)によって逆転されます。したがって、異常PTKまたはPTP機能は、多くの遺伝または獲得したヒト疾患33、4、5、64,5,6につながる。Src相モロジー2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、プロトオンコジーンPTPN117によってコードされる広く発現された非受容体型PTPであり、Ras/Raf/ERK、PI3K/Akt、またはJAK/STATシグナル伝達経路の活性化によるシグナル伝達を伴う多数の生理学的プロセスの主要な調節因子である。通常、SHP2活性は異常なシグナル伝達を防ぐために厳しく調節される。基礎条件下ではSHP2はそのN末端SH2ドメインによって自動抑制され、触媒ホスファターゼドメイン内の活性部位へのアクセスをブロックする(図1A)9、10。9,10Figure 1A細胞活性化の際、チロシンリン酸化結合タンパク質はSHP2をリクルートし、活性な立体構造を採用し、活性部位がその基質にアクセスできるようになりました。多くの癌においてSHP2活性が上昇している。PTPN11における体細胞機能利得(GOF)突然変異は、主に白血病において同定されており、N-SH2ドメインのホスファターゼドメインへの結合を防止し、構成的に活性なSHP2(図1B)11を生じる。11PTPN11における生殖細胞系GOF突然変異は、ヌーナン症候群の症例の50%を担い、悪性腫瘍のリスクが高い発達障害である12。PTPN11変異がまれである固形腫瘍では、リン酸化結合タンパク質のレベルが高いほどSHP2活性が増強される(図1C)。SHP2は免疫チェックポイントシグナル伝達にも重要であり、BTLAやPD−1などのチェックポイント受容体は主要なシグナル伝達分子を脱リン酸化してSHP2をリクルートし、免疫細胞活性化13、14、1514,15を予防する。13

低分子のPtPsを標的にすることは、PtPsの活性部位が高度に保存され、高い荷電性を有するため、困難でした。活性部位を標的とする阻害剤は、しばしば強力であるが、不十分な選択性および経口バイオアベイラビリティ1616、17、18、19、20、21、22を示す。,17,18,19,20,21,22実際、報告された多くのSHP2阻害剤は、細胞23における選択性の低下と有効性の欠如に苦しんでいる。最近、優れた効力と優れた選択性を有するSHP2のアロステリック阻害剤(例えば、SHP09924およびRMC-455025)が報告され、SHP2阻害剤への新たな関心を引き起こしている。SHP099およびRMC-4550に基づく化合物は、現在、第I相臨床試験中に、受容体チロシンキナーゼ(RTK)経路活性化26,27,27で固形腫瘍を治療する。画期的な一方で、これらの化合物は、血液癌患者28、29、30,29,30のかなりの数の血液癌患者で白血病を駆動するSHP2発癌性変異体の多くに対して効果がない。SHP2発癌性変異体に対するSHP099様化合物の効力の欠如は、SHP2変異体で破壊される不活性で閉じた立体構造を結合して安定化させることによってSHP2活性を阻害するため、そのユニークなアロステリック機構に由来する。また、最近の報告31に基づいて、SHP099様阻害剤で治療された患者における適応抵抗機構は、かなり考えられる。その結果、その活性、開放状態を標的とする次世代SHP2阻害剤の開発は、激しい研究の対象となっている。

細胞内の新規SHP2阻害剤の特性評価は、リード最適化プロセスの不可欠な側面である。重要なことに、生理学的条件下での阻害剤の実証された標的関与は、薬用化学のリソースが有望な細胞有効性を有する化合物に効率的に展開されるというさらなる信頼を提供する。過去には、その標的に対する低分子阻害剤の結合を評価するいくつかの方法が開発されてきたが、主にプロテインキナーゼ32に対して。SHP2細胞標的エンゲージメントアッセイを開発するために、セルラー熱シフトアッセイ33を利用した。このアッセイは、タンパク質34に対するインビトロ熱シフト(PTS)アッセイと同様に、標的タンパク質の熱安定性を監視し、これは典型的には小分子の結合によって変化する。元のアッセイは、抗体を利用して標的タンパク質レベルを定量化する低スループットアッセイです。あるいは、β-ガラクトシダーゼ酵素フラグメント相補(EFC)アッセイを利用した熱シフトアッセイの最近報告された変異体を選択した(図2)35。35これらの実験では、目的のタンパク質は、増強されたProLabelタグ(ePL、βガラクトシダーゼの42アミノ酸断片)を運ぶN-またはC末端融合タンパク質として細胞内で発現される。細胞は384ウェルPCR適合プレートに移され、目的の化合物と共にインキュベートされます。サーモサイクラーは、細胞に温度勾配を適用するために利用され、そのタンパク質は熱安定性に基づいて温度が上昇するにつれて変性し、凝集する。候補化合物が目的のタンパク質に結合し安定化する能力は、そのタンパク質の熱安定性の向上をもたらす。したがって、細胞の溶解に続いて、候補化合物によって安定化されたタグ付きタンパク質は、車両制御でインキュベートされた細胞のタグ付きタンパク質よりも高い温度で溶液中に残る。レポーター酵素アクセプタ(EA)は、可溶性ePLタグ付きタンパク質を補体することができ、発光基質を用いた検出可能なβガラクトシダーゼ活性をもたらす。

我々は最近、384ウェル形式36で野生型SHP2(SHP2-WT)および頻繁なSHP2発癌変種(SHP2-E76K)用の堅牢なセルラー熱シフトアッセイを開発した。ここでは、細胞内のSHP2阻害剤による標的関与を確実に検出し、阻害力と細胞熱シフトデータとの間の高い相関を示すこのアッセイの詳細なプロトコルを報告する。一般的なアッセイのワークフローを 図 3に示します。当社のプラットフォームは、N末端タグ付きフルレングスePL-SHP2融合タンパク質を使用しています。対応する pICP-ePL-N-SHP2-WT および pICP-ePL-N-SHP2-E76K 発現プラスミドの生成については、当社の最近の出版物36を参照してください。このアッセイは、熱勾配を使用してSHP2熱プロファイルを確立し、阻害剤の存在下または不存在下でのSHP2融解温度を決定するために行うことができる。いったん熱プロファイルが確立されると、等温条件下でも実施でき、阻害剤の線量応答評価が可能になります。両方のタイプの実験を以下に説明する。

Protocol

1. 細胞培養・試薬の製造 10%の牛血清、1x抗生物質/抗ミコティック、20 mM HEPES、および1 mMのナトリウムピルビン酸を用いて500mLの成長培地を処方する。4 °Cで保管。 凍結したオリジナルストックボトルから、セルラー熱シフト試薬(EA試薬、溶汁バッファー、基材)を解凍します。 試薬と緩衝液を2 mLアリコートとして分配し、-20°Cで保管する。注:再現性のために凍結/解?…

Representative Results

SHP2-WTの熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に対して典型的かつ一貫した狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした(図4A)。SHP2 は、2 つの SH2 ドメインと触媒ドメインの 3 つの独立したドメインで構成されています (図 1)。自動抑制された閉じた立体構造では、これらのドメインは自己関連付け;熱プロファイル実験で観?…

Discussion

細胞内のSHP2ホスファターゼへの低分子の直接結合を確認できる標的関与アッセイを発表しました。このアッセイは、低親和性阻害剤と高親和性阻害剤を区別し、重要なことに、GOF発癌性SHP2-E76K変異体に対するSHP099型のアロステリック阻害剤による効力の欠如を確認することができる。この小型アッセイの強みは、SHP2阻害剤スクリーニングキャンペーンに統合される能力です。未知の化学物?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所補助金1R21CA195422(L.T.)、エプスタインファミリー財団賞(N.D.P.C.)、NCIがんセンターサポートグラントP30CA030199によって支援されました。さらに、このプロジェクトは、化学生物学コンソーシアム契約No.の下で、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部で資金提供されています。HHSN261200800001E.本書の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734
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Referências

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Keywords: SHP2PhosphataseCell SignalingCancer TherapySmall Molecule InhibitorsTarget EngagementCell-based AssayHEK293 T-cellsTransfection384-well PlatesLiquid Handling
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Lambert, L. J., Romero, C., Sheffler, D. J., Celeridad, M., Cosford, N. D. P., Tautz, L. Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (161), e61457, doi:10.3791/61457 (2020).
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