通过 SHP2 （PTPN11） 磷酸酶抑制剂评估细胞目标参与度
Summary
评估候选抑制剂在完整细胞中参与目标的能力对药物的发现至关重要。该协议描述了一个384井格式的细胞热移检测，可靠地检测针对野生型SHP2或其致癌变异的抑制剂的细胞靶接触。
Abstract
Src-同源性2（SH2）域包含磷酸酶2（SHP2）， 由PTPN11 原生基因编码，是受体酪氨酸激酶（RTK）驱动细胞信号的关键中介，促进细胞生存和增殖。此外，SHP2由免疫检查点受体招募，以抑制B和T细胞活化。异常SHP2功能已牵连到许多癌症的发展，进展和转移。事实上，小分子SHP2抑制剂最近已进入临床试验，用Ras/Raf/ERK通路活化治疗实体肿瘤，包括具有一些致癌Ras突变的肿瘤。然而，目前SHP2抑制剂的一类对白血病中频繁发生的SHP2致致致变异无效，而针对致癌SHP2的特定小分子的发育是当前研究的主题。大多数药物发现运动涉及细胞细胞酸蛋白（如 SHP2）的一个常见问题是，推动化学发现的主要检测方法通常是体外检测，不报告候选化合物的细胞靶度。为了提供一个测量细胞靶位参与度的平台，我们开发了野生型和突变型SHP2细胞热移测定。这些测定能够可靠地检测SHP2抑制剂在细胞中的目标接触。在这里，我们提供了该测定的综合方案，为SHP2抑制剂的评估和表征提供了宝贵的工具。
Introduction
酪氨酸磷酸化在细胞1、2,的信号转导中起着重要的作用。这种转化后修饰由蛋白质酪氨酸激酶（PTKs）催化，由蛋白质酪氨酸磷酸盐（PTPs）逆转。因此，异常PTK或PTP功能导致许多遗传或后天人类疾病3，4，5，6。,5,63,Src-同源性2（SH2）包含磷酸酶2（SHP2）是一种广泛表达的非受体类型PTP编码的原生基因PTPN117，是许多生理过程的关键调节器，涉及信号转导通过激活Ras/Raf/ERK，PI3K/Akt，或JAK/STAT信号通路8。通常，SHP2 活动受到严格调节，以防止异常信令。在基础条件下，SHP2由其N端子SH2域自动抑制，该域阻止访问催化磷酸酶域内的活性位点（图1A）9，10。9,10Figure 1A细胞活化后，酪氨酸磷酸化结合蛋白会招募SHP2，使其采用活性构象，其中活性位点现在可进入其基质。在许多癌症中，SHP2活性升高。PTPN11中的体动增益（GOF）突变主要在白血病中得到识别，并防止N-SH2域与磷酸酶域结合，导致形成活性SHP2（图1B）11。11PTPN11 中的细菌性 GOF突变导致 50% 的努南综合征病例，这是一种发育障碍，恶性肿瘤风险增加 12。在PPN11突变很少的实体肿瘤中，磷酸化结合蛋白的含量更高，导致SHP2活性增强（图1C）。SHP2对于免疫检查点信号也很重要，因为BTLA或PD-1等检查点受体招募SHP2去磷化关键信号分子，防止免疫细胞激活13、14、15。13,14,15
以小分子为目标PPT一直是一个挑战，因为PTP的活性位点具有高度的保存和高充电性;针对活动位点的抑制剂通常有效，但表现出较差的选择性和口服生物利用度16，17，18，19，20，21，22。16,17,18,19,20,21,22事实上，许多报告的SHP2抑制剂在细胞23中缺乏选择性和缺乏疗效。最近，SHP2的异体抑制剂具有良好的效力和优异选择性的报告（例如，SHP09924和RMC-455025），并引发了人们对SHP2抑制剂的重新兴趣。基于SHP099和RMC-4550的化合物目前处于第一阶段临床试验中，用受体酪氨酸激酶（RTK）通路激活26，27治疗实体肿瘤。虽然具有开创性，这些化合物是无效的许多SHP2的致癌突变体，推动白血病发生在大量的血液癌患者28，29，30。28,29,30SHP099样化合物对SHP2致致致变异的缺乏效力源于其独特的等量性机制，因为它们通过结合和稳定SHP2突变体中被破坏的不活跃的闭合构象抑制SHP2活性。此外，根据最近的一份报告31，适应抵抗机制在治疗SHP099样抑制剂的患者是相当可想而知的。因此，开发针对其主动、开放状态的下一代SHP2抑制剂是一个激烈研究的主题。
新型SHP2抑制剂在细胞中的表征是铅优化过程的一个重要方面。关键的，经过验证的靶向作用，抑制剂在生理条件下提供一个额外的信心水平，药用化学资源被有效地部署在具有有希望的细胞疗效的化合物上。过去，已经开发出几种评估小分子抑制剂与靶点结合的方法，主要针对蛋白激酶32。为了开发SHP2细胞靶点接触性测定，我们利用细胞热移检测33。这种测定类似于蛋白质34的体外热移（PTS）测定，监测目标蛋白质的热稳定性，这种稳定性通常由小分子的结合改变。原始检测是一种低通量检测，利用抗体来量化目标蛋白水平。或者，我们选择了最近报道的热移位测定的变种，利用β-半乳糖酶片段补充（EFC）测定（图2）35 。35对于这些实验，感兴趣的蛋白质在细胞中表达为N-或C-终端融合蛋白，携带增强的ProLabel标签（ePL，β-半乳糖酶的42个氨基酸片段）。然后将细胞转移到384孔PCR兼容板，并孵育感兴趣的化合物。热循环器用于对细胞施加温度梯度，其蛋白质会随着温度的升高而变性和聚合。这些细胞的热稳定性取决于其温度的升高。候选化合物结合和稳定感兴趣的蛋白质的能力将导致该蛋白质的热稳定性增加。因此，在细胞分解后，那些由候选化合物稳定下来的标记蛋白将在高于通过车辆控制孵育的细胞标记蛋白的高温下留在溶液中。报告器酶接受器（EA）能够补充可溶性ePL标记蛋白，从而使用发光基β-半乳糖酶活性。
我们最近开发了一个强大的细胞热移测定野生型SHP2（SHP2-WT）和频繁的SHP2致癌变种（SHP2-E76K）在小型384井格式36。在这里，我们报告此检测的详细协议，该检测可可靠地检测SHP2抑制剂在细胞中的目标参与度，并证明抑制剂效力与细胞热移数据之间的高度相关性。一般检测工作流如图3 所示。我们的平台使用N-终端标记全长ePL-SHP2融合蛋白。有关生成相应的 pICP-ePL-N-SHP2-WT 和 pICP-ePL-N-SHP2-E76K 表达质粒，请参阅我们最近的出版物36。此测定可以使用热梯度进行，以建立 SHP2 热剖面，并确定存在或不存在抑制剂的 SHP2 熔化温度。一旦建立了热剖面，也可以在等温条件下进行，从而允许抑制剂剂量反应评估。下面描述了这两种类型的实验。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提出了一个目标参与性测定，可以确认小分子与细胞中的SHP2磷酸酶的直接结合。该测定可以区分低亲和力抑制剂和高亲和力抑制剂，更重要的是，证实SHP099型的类体抑制剂对高致癌SHP2-E76K突变体缺乏效力。这种小型化测定的优势在于它能够集成到SHP2抑制剂筛选运动中。检测方法通过未知化学物质确认细胞内与SHP2结合的能力，是保证有效部署筛选资源的重要能力。总体而言，小型化协议是可?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院赠款1R21CA195422（L.T.）、爱泼斯坦家庭基金会奖（至N.D.P.C.）和NCI癌症中心支持赠款P30CA030199的支持。此外，该项目由国家癌症研究所、国家卫生研究院的联邦资金提供，根据《化学生物学联合会合同第12号》提供。HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着得到美国政府的认可。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
Referências
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases–from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. . Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- . Clinical Trial NCT03114319 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019)
- . Clinical Trial NCT03634982 Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019)
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
