Detecção de Phytophthora capsici em água de irrigação usando amplificação isotérmica mediada por loop
Summary
Desenvolvemos um método para detectar zoospores Phytophthora capsici em fontes de água usando um método de extração de DNA de papel filtro juntamente com um ensaio de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) que pode ser analisado no campo ou no laboratório.
Abstract
Phytophthora capsici é um patógeno oomycete devastador que afeta muitas culturas solanáceas e cucurbits importantes, causando perdas econômicas significativas na produção de vegetais anualmente. Phytophthora capsici é transmitida pelo solo e um problema persistente nos campos vegetais devido às suas estruturas de sobrevivência de longa duração (oosporos e clamídias) que resistem ao intemperamento e degradação. O principal método de dispersão é através da produção de zoosporos, que são esporos sinalizados de célula única que podem nadar através de filmes finos de água presentes em superfícies ou em poros de solo cheios de água e podem se acumular em poças e lagoas. Portanto, as lagoas de irrigação podem ser uma fonte do patógeno e dos pontos iniciais de surtos da doença. A detecção de P. capsici na água de irrigação é difícil usando métodos tradicionais baseados em cultura porque outros microrganismos presentes no ambiente, como pythium spp., geralmente superreceu P. capsici tornando-o indetectável. Para determinar a presença de esporos de P. capsici em fontes de água (água de irrigação, escoamento, etc.), desenvolvemos um método de filtro à base de bomba manual (8-10 μm) que captura os esporos do patógeno (zoospores) e é posteriormente usado para amplificar o DNA do patógeno através de um novo ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) projetado para a amplificação específica de P. Este método pode amplificar e detectar DNA a partir de uma concentração tão baixa quanto 1,2 x 102 zoospores/mL, que é 40 vezes mais sensível do que o PCR convencional. Não foi obtida amplificação cruzada ao testar espécies intimamente relacionadas. A LÂMPADA também foi realizada utilizando um corante de mistura mestre lampimétrica, exibindo resultados que poderiam ser lidos a olho nu para detecção rápida no local. Este protocolo pode ser adaptado a outros patógenos que residem, acumulam ou são dispersos através de sistemas de irrigação contaminados.
Introduction
A reciclagem de água em fazendas e viveiros está se tornando cada vez mais popular devido ao aumento dos custos de água e preocupações ambientais por trás do uso da água. Muitos métodos de irrigação foram desenvolvidos para os produtores reduzirem a propagação e a ocorrência de doenças vegetais. Independentemente da fonte da água (irrigação ou precipitação), o escoamento é gerado, e muitos produtores de hortaliças e berçários têm uma lagoa para coletar e reciclar o escoamento1. Isso cria um reservatório para possível acúmulo de patógenos favorecendo a disseminação de patógenos quando a água reciclada é usada para irrigar as culturas2,,3,4. Os patógenos vegetais oomycete se beneficiam particularmente dessa prática, pois os zoosporos se acumularão na água e o esporo dispersivo primário é auto-motil, mas requer água superficial5,,6,,7. Phytophthora capsici é um patógeno oomycete que afeta um número significativo de culturas solanáceas e cucurbitas de diferentes maneiras8. Muitas vezes, os sintomas são amortecimento de mudas, raízes e podridão da coroa; no entanto, em culturas como pepino, abóbora, melão, abóbora, melancia, berinjela e pimenta, colheitas inteiras podem ser perdidas devido à podridão de frutas9. Embora existam métodos conhecidos de detecção desse patógeno vegetal, a maioria requer uma infecção que já tenha ocorrido, o que é tarde demais para que quaisquer fungicidas preventivos tenham um efeito significativo10.
O método tradicional de teste da água de irrigação para a detecção e diagnóstico de microrganismos direcionados é uma abordagem antiquada quando a velocidade e a sensibilidade são cruciais para o sucesso e a produção rentável da cultura11,12. O tecido vegetal suscetível ao patógeno-alvo (por exemplo, berinjela para P. capsici) é anexado a uma armadilha modificada que é suspensa em uma lagoa de irrigação por um período prolongado antes de ser removida e inspecionada para infecção. As amostras do tecido vegetal são então banhadas em mídia semi-seletiva (PARPH) e incubadas para o crescimento da cultura, em seguida, a identificação morfológica é realizada usando um microscópio composto13. Existem outros métodos de detecção semelhantes para outros patógenos vegetais usando mídia seletiva e emplacando pequenas quantidades de água contaminada antes de sub-cultivo14,15. Esses métodos requerem entre 2 e 6 semanas, várias rodadas de subcultura para isolar o organismo, e experimentam em diagnósticos de Phytophthora para serem capazes de reconhecer os principais caracteres morfológicos de cada espécie. Esses métodos tradicionais não funcionam bem para detecção de água de irrigação contaminada por P. capsici devido a fatores como a interferência de outros microrganismos que também estão presentes nas fontes de água. Alguns microrganismos de rápido crescimento, como pythium spp. e bactérias transmitidas pela água podem crescer demais na placa tornando P. capsici indetectável16,17.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um método molecular sensível e específico que possa ser utilizado tanto em ambientes de campo quanto em laboratório para detectar zoospores P. capsici na água de irrigação. O protocolo inclui o desenvolvimento de um novo primer de amplificação isotérmica mediada em loop (LAMP) capaz de amplificar especificamente P. capsici, baseado em um fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici18,19. Um primer LAMP previamente desenvolvido de Dong et al. (2015) foi utilizado em comparação com o ensaio que foi desenvolvido para este estudo20.
O ensaio LAMP é uma forma relativamente nova de detecção molecular que tem sido demonstrada ser mais rápida, sensível e específica do que a reação convencional de cadeia de polimerase (PCR)21. Em geral, os ensaios convencionais de PCR não podem detectar menos de 500 cópias (1,25 pg/μL); em contraste, estudos anteriores mostraram que a sensibilidade da LÂMPADA pode ser 10 a 1.000 vezes maior que a pcr convencional e pode facilmente detectar até mesmo 1 fg/μL de DNA genômico22,23. Além disso, o ensaio pode ser realizado rapidamente (muitas vezes em 30 minutos) e no local (no campo) usando um bloco de aquecimento portátil para amplificação e um corante colorimétrico que muda de cor para uma amostra positiva (removendo a necessidade de eletroforese). Neste estudo, comparamos a sensibilidade dos ensaios PCR e LAMP utilizando um método de extração de filtro. O método de detecção proposto permite que pesquisadores e agentes de extensão detectem facilmente a presença de esporos de P. capsici de diferentes fontes de água em menos de duas horas. O ensaio é provado ser mais sensível do que o PCR convencional e foi validado in situ detectando a presença do patógeno na água de irrigação usada por um produtor. Este método de detecção permitirá que os produtores estimem a presença e a densidade populacional do patógeno em várias fontes de água que estão sendo utilizadas para irrigação, prevenindo surtos devastadores e perdas econômicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O teste da água de irrigação para fitopatógenos é um passo crucial para os produtores que utilizam lagoas de irrigação e água reciclada27. As lagoas de irrigação fornecem um reservatório e um terreno fértil para uma série de fitopatógenos, uma vez que o excesso de água de irrigação é direcionado do campo para a lagoa carregando consigo quaisquer patógenos que possam ter estado presentes16,,27. O método tradicional de de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho recebeu o apoio financeiro da Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP000016659. Os autores agradecem ao Dr. Pingsheng Ji, universidade da Geórgia e à Phytophthora sppDra. Agradecemos também li Wang e Deloris Veney por sua assistência técnica durante todo o estudo.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
Referências
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
