Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo
Summary
Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d’acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un’amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.
Abstract
Phytophthora capsici è un patogeno oomiceto devastante che colpisce molte importanti colture di conforto e cucurbit causando perdite economiche significative nella produzione vegetale ogni anno. Phytophthora capsici è di origine del suolo e un problema persistente nei campi vegetali a causa delle sue strutture di sopravvivenza di lunga durata (oospores e chlamydospores) che resistono agli intemperie e al degrado. Il metodo principale di dispersione è attraverso la produzione di zoospores, che sono monotono, spore flagellate che possono nuotare attraverso sottili pellicole d’acqua presenti sulle superfici o in pori del suolo pieni d’acqua e possono accumularsi in pozzanghere e stagni. Pertanto, gli stagni di irrigazione possono essere una fonte dell’agente patogeno e dei punti iniziali dei focolai di malattia. Il rilevamento di P. capsici nell’acqua di irrigazione è difficile utilizzando metodi tradizionali basati sulla coltura perché altri microrganismi presenti nell’ambiente, come Pythium spp., di solito sovrasessero P. capsici rendendolo inosservabile. Per determinare la presenza di spore P. capsici nelle fonti d’acqua (acqua di irrigazione, deflusso, ecc.), abbiamo sviluppato un metodo di filtro a base di pompa a mano (8-10 m) che cattura le spore dell’agente patogeno (zoospore) e viene successivamente utilizzato per amplificare il DNA dell’agente patogeno attraverso un nuovo esempio di amplificazione isotermica mediata dal ciclo (LAMP) progettato per l’amplificazione specifica dei tappi Pici. Questo metodo può amplificare e rilevare il DNA da una concentrazione a partire da 1,2 x 102 zoospores/mL, che è 40 volte più sensibile della PCR convenzionale. Non è stata ottenuta alcuna amplificazione incrociata durante il test di specie strettamente correlate. LAMP è stato anche eseguito utilizzando un colorante mix master LAMP colorimetrico, visualizzando risultati che potrebbero essere letti ad occhio nudo per il rilevamento rapido in loco. Questo protocollo potrebbe essere adattato ad altri agenti patogeni che risiedono, si accumulano o sono dispersi tramite sistemi di irrigazione contaminati.
Introduction
Il riciclo dell’acqua nelle aziende agricole e negli asili nido sta diventando sempre più popolare a causa dell’aumento dei costi dell’acqua e delle preoccupazioni ambientali alla base dell’utilizzo dell’acqua. Molti metodi di irrigazione sono stati sviluppati per i coltivatori per ridurre la diffusione e l’insorgenza di malattie vegetali. Indipendentemente dalla fonte dell’acqua (irrigazione o precipitazioni), viene generato il deflusso, e molti coltivatori di ortaggi e vivaio hanno uno stagno per raccogliere e riciclare ildeflusso 1. Questo crea un serbatoio per un possibile accumulo di agenti patogeni favorendo la diffusione di agenti patogeni quando l’acqua riciclata viene utilizzata per irrigare lecolture 2,3,4. Gli agenti patogeni delle piante di oomicete beneficiano particolarmente di questa pratica in quanto gli zoospore si accumulano in acqua e la spore dispersiva primaria è auto-motile ma richiedeacqua superficiale 5,6,7. Phytophthora capsici è un agente patogeno oomicete che colpisce un numero significativo di colture di conforto e cucurbit in modi diversi8. Spesso, i sintomi sono smorzamento-off di piantine, radice e marciume corona; tuttavia, in colture come cetriolo, zucca, melone, zucca, anguria, melanzane e pepe, interi raccolti possono essere persi a causa del marciumedella frutta 9. Anche se ci sono metodi noti per rilevare questo agente patogeno della pianta, la maggior parte richiedono un’infezione che è già avvenuta che è troppo tardi per eventuali fungicidi preventivi per avere un effettosignificativo 10.
Il metodo tradizionale per testare l’acqua di irrigazione per il rilevamento e la diagnosi di microrganismi mirati è un approccio antiquato quando velocità e sensibilità sono cruciali per il successo e la produzione di coltureredditizie 11,12. Il tessuto vegetale suscettibile all’agente patogeno mirato (ad esempio, melanzane per P. capsici)è attaccato a una trappola modificata che viene sospesa in uno stagno di irrigazione per un periodo prolungato prima di essere rimosso e ispezionato per l’infezione. I campioni del tessuto vegetale vengono poi placcati su supporti semi-selettivi (PARPH) e incubati per la crescita della coltura, quindi l’identificazione morfologica viene eseguita utilizzando un microscopiocomposto 13. Ci sono altri metodi di rilevamento simili per altri agenti patogeni vegetali che utilizzano supporti selettivi e placcano piccole quantità di acqua contaminata prima di sub-culturing14,15. Questi metodi richiedono da 2 a 6 settimane, diversi cicli di sub-culturing per isolare l’organismo, e l’esperienza sulla diagnostica Phytophthora per essere in grado di riconoscere i caratteri morfologici chiave di ogni specie. Questi metodi tradizionali non funzionano bene per il rilevamento dell’acqua di irrigazione contaminata da P. capsici a causa di fattori come l’interferenza di altri microrganismi che sono presenti anche nelle fonti d’acqua. Alcuni microrganismi in rapida crescita come Pythium spp. e batteri a base d’acqua possono sovracrescere sulla piastra rendendo P. capsici inosservabile16,17.
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo molecolare sensibile e specifico che possa essere utilizzato sia in campo che in laboratorio per rilevare gli zoospori P. capsici nell’acqua di irrigazione. Il protocollo include lo sviluppo di un nuovo set di primer LAMP (IOthermal amplification) mediato a ciclo continuo in grado di amplificare specificamente P. capsici, basato su un frammento di coppia di 1121 basi (bp) di P. capsici18,19. Un primer LAMP sviluppato in precedenza da Dong et al. (2015) è stato utilizzato in confronto al saggio che è stato sviluppato per questo studio20.
Il test LAMP è una forma relativamente nuova di rilevamento molecolare che è stato dimostrato di essere più rapida, sensibile e specifica rispetto alla reazione a catena polimerasi convenzionale (PCR)21. In generale, i saggi PCR convenzionali non sono in grado di rilevare meno di 500 copie (1,25 pg/L); al contrario, studi precedenti hanno dimostrato che la sensibilità di LAMP può essere da 10 a 1.000 volte superiore rispetto alla PCR convenzionale e può facilmente rilevare anche 1 fg/L di DNA genomico22,23. Inoltre, il saggio può essere effettuato rapidamente (spesso in 30 min) e in loco (nel campo) utilizzando un blocco di riscaldamento portatile per l’amplificazione e un colorante colorimetrico che cambia colore per un campione positivo (eliminando la necessità di elettroforesi). In questo studio, abbiamo confrontato la sensibilità dei saggi PCR e LAMP utilizzando un metodo di estrazione del filtro. Il metodo di rilevamento proposto consente ai ricercatori e agli agenti di estensione di rilevare facilmente la presenza di spore P. capsici provenienti da diverse fonti d’acqua in meno di due ore. Il saggio è dimostrato di essere più sensibile rispetto al PCR convenzionale ed è stato convalidato in situ rilevando la presenza dell’agente patogeno nell’acqua di irrigazione utilizzata da un coltivatore. Questo metodo di rilevamento permetterà ai coltivatori di stimare la presenza e la densità di popolazione dell’agente patogeno in varie fonti d’acqua utilizzate per l’irrigazione, prevenendo focolai devastanti e perdite economiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sperimentazione dell’acqua di irrigazione per i fitopatogeni è un passo cruciale per i coltivatori che utilizzano stagni di irrigazione e acqua riciclata27. Stagni di irrigazione forniscono un serbatoio e terreno di allevamento per un certo numero di fitopatogeni come acqua di irrigazione in eccesso è diretto dal campo allo stagno portando con sé eventuali agenti patogeni che possono essere statipresenti 16,27. Il metodo tradizionale…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto il sostegno finanziario della Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID : FP00016659. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Pingsheng Ji, Università della Georgia e la Dott.ssa Anne Dorrance, Ohio State University per aver fornito culture pure di Phytophthora spp. Ringraziamo anche Li Wang e Deloris Veney per l’assistenza tecnica durante tutto lo studio.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
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