テトロドトキシンマイクロインジェクションによる可逆不活性化による排卵調節におけるラット脳の離散領域の役割の解明
Summary
このプロトコルは、低コストのマイクロインジェクションシステムの構築、深部脳構造への立体的移植、および目覚めおよび拘束されていないラットにおけるテトロドトキシンの時回マイクロ注射の手順を記述する。目標は、その神経活動を阻害することによって排卵の調節における視床下部構造の関与を明らかにすることです.
Abstract
多くの実験的なアプローチは、排卵の調節における脳の役割を研究するために使用されてきた。例としては、ニューロン群の病変および耳障りなことが挙げられるが、これは両方とも標的領域の完全性を永久に損なう侵襲的方法である。これらの方法は、急性および時間的調節メカニズムの分析に影響を与える可能性のある担保効果を伴う。特定の脳領域を対象としたガイドカニューレの立体的移植は、回復期間が続き、研究者が手術の望ましくない影響の消失後に異なる薬物をマイクロインジェクトすることを可能にする。テトロドトキシンは、一過性のナトリウム依存作用電位を阻害し、標的領域における全ての神経活動を遮断するため、多様な生理学的過程における複数の脳領域の役割を決定するために用いられている。このプロトコルは、この方法を、エストルースサイクルおよび排卵の評価のための戦略と組み合わせて、エストルースサイクルの特定の段階の特定の時間における排卵調節における離散脳領域の役割を明らかにする。目覚めと拘束されていないラット (ラタス・ノルベギカス) は、麻酔薬やストレスホルモンが排卵に及ぼす遮断効果を避けるために使用されました。このプロトコルは、他の種、脳標的および薬理学的薬剤に容易に適応して、異なる生理学的プロセスを研究することができる。この方法の将来の改善には、ガイドカニューラの代わりに小径のガラス毛細血管を使用したマイクロインジェクションシステムの設計が含まれます。これは、移植中に損傷を受けた組織の量を減少させ、注入された薬物が標的領域外に広がることを減少させる。
Introduction
排卵は、1つ以上の成熟した卵母細胞が一度毎エストラル/月経周期から1回卵巣から放出されるプロセスである。すべての哺乳類種は繁殖する配偶子の生産に依存しているので、排卵を調節するメカニズムの理解は、生物医学、家畜産業、絶滅危惧種の維持に至るまでの分野で大きな影響を与えます。排卵は視床下部下垂体-卵巣軸によって調節され、いくつかの視床下部および視床外領域、下垂体前葉座のゴナドロープ、および卵母細胞および顆粒球細胞と共に卵巣卵胞を形成する卵巣卵胞を形成する1。
卵巣卵胞は成長し、成長し、最終的には卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンの強壮性および精神病分分に応答して排卵する、ゴナトロープによって分泌される2つのゴナドトロピン。ゴナドトロピン分泌のパターンは、適切な濾胞の発達と排卵のために極めて重要であり、それは性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)1、2によって調節される。この神経ペプチドは、基底の全脳症に散在するニューロンによって合成され、視床下部と下垂体前を結びつける門脈管系に分泌される。GnRH-ニューロンの分泌活性は、多様な脳構造から生じるシナプス入力によって変調される。これらの構造は、食物の入手可能性、光周期の長さ、血液中のホルモン濃度など、生物の外部および内部環境の状態に関する情報を伝える。この意味で、それらは、それぞれの種の生殖パターンを形作り、排卵を支配するメカニズムを適切に理解するために、そのような構造の特定の役割を決定する必要があります。例として、エストルースサイクル中のエストラジオールレベルの変動がGnRHの分泌を調節することが示されている。しかし、GnRHニューロンは、そのような変化を検出するために必要なエストラジオール受容体アイソフォームを発現していない。これらの受容体を発現するニューロンの2つの集団は、それぞれ第3心室のロストラル室近親子領域と円弧核内に位置し、GnRHニューロンを有するスタブリシナプスである。これらのニューロンがエストラジオールの濃度を解釈し、GnRH分泌の強力なインダクタであるキスペプチンを放出することによってGnRHニューロンの活性を刺激することを示唆する証拠がある。
サーミックまたは化学病変、ならびに機械的聴覚障害を含む実験により、研究者は排卵4、5、6、7、8、9、10、11、12の調節におけるいくつかの脳構造の関与を決定することができた.しかし、これらの実験は、侵襲的で外傷性であるという欠点を有し、治療の効果を評価する前に数日間の回復を必要とし、治療の急性効果の分析を妨げる。さらに、それらは永続的に標的領域に影響を与え、長期的には他の生理学的プロセスを破壊する。これらの問題により、これらの実験の結果は、通常、動物の体内の恒恒湿補償機構によって隠され、領域が関与する時間的調節ダイナミクスに関する正確な情報を抽出することはかなり困難である。
ガイドカニューレを介してニューロンの活動を一過性に破壊する薬物の微小注射は、上記の欠点を上回る適切な代替手段である。カニューレは、立体的手術によって任意の脳領域に配置することができ、研究者は手術の交核化効果が消失した後に薬物治療を開始することができます。薬物の時限マイクロインジェクションは、研究者がプロセスの特定のステップに地域の貢献に関する仮説をテストすることを可能にし、目覚めの抑制または自由に動く動物で行うことができる。局所麻酔薬、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよびテトロドトキシン(TTX)などの生物学的毒素を含む様々な薬物を、特定の時期に対象領域にマイクロインジェクションすることができる。
TTXは、他の脊椎動物や無脊椎動物だけでなく、フグの体内に住んでいる細菌によって合成された生物学的毒素です。TTXはナトリウムチャネルの選択的および一時的な遮断を通して神経活動を沈黙させ、その結果、ナトリウム依存性作用電位の阻害をもたらす。TTXの存在下では、細胞は脱分極期に変化を経験し、興奮しないが生き続ける。TTXの遮断効果は、その分子組成によって説明される:グアニジニウム基は、ナトリウムチャネルの細胞外の側面を通過することができるが、分子の残りの部分は、そのサイズのために通過することができないので、それは立ち往生し、チャネル13、14、15、16、17をブロックします.TTXの作用機序は、インビトロとインビボの両方の神経系を研究するためのツールとしての使用を可能にした。この毒素の脳内注射は、記憶保持18、睡眠および覚醒19、場所認識20、空間ナビゲーション21、薬物乱用22、体温調節23、統合失調症24の発症、性行動25および排卵の調節などのいくつかのプロセスにおける離散的な脳領域の役割を研究するために使用されてきた とりわけ。このプロトコルでは、目覚めのないラットにおけるTTXマイクロインジェクションによる視床下部核の一過性不活性化の排卵に及ぼす影響について述べた。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、一時的に不活性化する方法について説明します, 任意の時点で, 目を覚ますと、拘束されていないラットの脳内の離散領域.彼らのエストルースサイクルを追跡し、排卵を評価するための簡単な方法も提供されています。このプロトコルは、TTX処理動物の排卵結果と車両処理動物の排卵結果を比較することによって排卵を促進するメカニズムに対する特定の脳領域の寄与を簡単?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ワシントン大学のレイモンド・サンチェスは、原稿編集における貴重な支援と、ジョージナ・コルテス M.Sc とシンティア・ハビエル M.Sc の技術支援に感謝しています。私たちはまた、ファカルタード・デ・エストゥディオス・サラゴサ:MVZで獣医サービスのメンバーに感謝しています。アドリアナ アルタミラノ、 MVZ.ロマン・エルナンデスとMVZ。実験動物の優れたメンテナンスとケアのためのドロレス-エリザベス・グスマン。このプロトコルで説明されている実験は、DGAPA-PAPIIT認可番号(IN216015およびCONACyT助成金番号:ロベルト・ドミンゲスに236908)で支持されました。カルロス・カミロ・シルバは、プログラム・デ・ドクマド・エン・シエンシアス・バイオメディカ、大学ナシオナル・エウトノマ・デ・メヒコ(UNAM)の博士課程の学生で、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(グラント番号:294555)によってサポートされています。
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
Referências
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
