Bu metodoloji, substrat sertliği, protein bileşimi ve hücre morfolojisi gibi hücre dışı matris ipuçlarının Schwann hücresi (SC) fenotipini düzenleyen mekanizmalarını göstermeyi amaçlamaktadır.
Travmatik periferik sinir sistemi (PNS) yaralanmaları şu anda tam fonksiyonel iyileşme yitirmek için uygun tedaviler eksikliği. Schwann hücreleri (SCs), PNS önemli glial hücreleri olarak, yaralanma sonrasında bir rejeneratif hücre fenotip içine dedifferentiating tarafından PNS rejenerasyon teşvik hayati bir rol oynamaktadır. Ancak, SCs defarklılaştırılmış devlet rejenerasyon için gerekli zaman dilimi boyunca korumak için zor ve çevreleyen ekstrasellüler matris (ECM) değişikliklerden etkilenir. Bu nedenle, SC’lerin rejeneratif potansiyeline ilişkin ipuçları sağlamak için SC’ler ile farklı ECM arasındaki karmaşık etkileşimin belirlenmesi esastır. Bunu gidermek için, farklı ECM proteinlerinin sertlik ve protein bileşiminin modüle edilebildiği bir platform sağlayan, ölçülü polidimetilsiloksane (PDMS) substratına adsord edildikleri bir strateji oluşturuldu. SC’ler ölçülebilir yüzeylere tohumlanmış ve SC fenotipinin dinamiklerini temsil eden kritik hücresel fonksiyonlar ölçüldü. SC protein ekspresyonu ile hücresel morfoloji arasındaki etkileşimi göstermek için, bireysel mikrotemas baskılı hücresel desenlere ek olarak SC’lerin farklı tohumlama yoğunlukları kullanıldı ve immünfloresans boyama ve batı lekesi ile karakterize edildi. Sonuçlar, daha küçük yayılma alanı ve hücresel uzama daha yüksek ölçüde olan hücrelerin sc rejeneratif phenotipik belirteçleri daha yüksek düzeyde teşvik gösterdi. Bu metodoloji sadece ECM ve SCs hücresel fonksiyonu arasındaki önemli ilişkiyi çözmek için başlar, ama aynı zamanda periferik sinir onarım biyomalzemelerin gelecekteki optimizasyonu için kurallar sağlar.
Periferik sinir sistemi (PNS) yaralanmaları hastalar için yaşam kalitesini tehlikeye atarak ve sosyoekonomik faktörlerin çok sayıda ile önemli bir etki yaratarak sağlık önemli bir klinik sorun olmaya devam etmektedir1,2. Schwann hücreleri (SC), PNS’deki başlıca glial hücreler olarak, PNS rejenerasyonuna neden olmak ve kısa boşluk yaralanmalarında fonksiyonel iyileşmelere yardımcı olmak için gerekli moleküler ve fiziksel ipuçlarını sağlar. Bunun nedeni, SC’lerin miyelinating veya Remak fenotip3’ten“onarım” hücre fenotipine ayrıştırma yeteneğine sahip olmasıdır. Onarım SC çeşitli şekillerde ayırt edici bir hücre fenotip. Yaralanmadan sonra, SC’ler hücre döngüsüne yeniden girerek çoğalma hızlarını artırır lar ve reinnervasyonu kolaylaştırmak için çeşitli transkripsiyonel faktörlerin ekspresyonuna başlarlar. C-Jun ve p75 NTR gibi bu faktörler, miyelin temel protein (MBP) gibi miyelinating SC belirteçleri, downregulated4,,5ise upregulated vardır. Buna ek olarak, SCs uzun olmak için morfolojideğiştirmek ve yaralanma site6genelinde Büngner bantları oluşturmak için birbirleri ile hizalanmış . Bu aksonlar için doğru distal hedef7genişletmek için fiziksel bir rehberlik mekanizması sağlar. Ancak, SCs kısa boşluk yaralanmalarında sinir rejenerasyonu teşvik etmek için sahip yeteneğine rağmen, fonksiyonel iyileşme sonucu ciddi yaralanmalarda kötü kalır. Bu kısmen ekstrasellüler matriks kaybı nedeniyle (ECM) rehberlik ipuçları, hem de uzun süreler boyunca rejeneratif fenotip korumak için SCs yetersizlik8.
Sinir rejenerasyon ve iyileşme süreci yakından yaralanma sonrasında bazal lamina durumuna bağlıdır. Bazal lamina rehberlik kolaylaştırır ve yaralanma9aşağıdaki bozulmadan kalır durumlarda akson ve SCs için ECM bağlı ipuçları sağlar sinir etrafında ECM bir tabakadır . ECM durumu ve hücrelere matris bağlı ipuçları sunmak için yeteneği hayati önem taşımaktadır ve daha önce farklı bağlamlarda çeşitli araştırılmıştır10,11,12,13,14. Örneğin, ECM sertliği gibi çoğalma ve farklılaşma11,,15,16gibi hücre fonksiyonları rehberlik göstermiştir. ECM bileşimi de farklı bir hücresel yanıt yol açabilir ve hücre içi sinyal yolları 17 ile göç ve farklılaşma gibi hücre davranışlarını düzenleyen17,18. Ayrıca, hücre morfolojisi, yayılma alanı ve hücresel uzama da dahil olmak üzere, fonksiyonudüzenleyen önemli bir rol oynamaktadır ve ECM bağlı ipuçları tarafından yönetilebilir19,20. Birçok önceki çalışmalarda kök hücrelerin tanımlanmış soylara farklıştırılması üzerinde duruldu, henüz SCs bir homeostatik fenotipi değiştirmek için benzer bir yeteneğe sahip, sağlıklı bir sinir içinde yetişkin SC, bir onarım SC protein ve büyüme faktörleri salgılama yeteneğine sahip ise Sinir yaralanması aşağıdaki ECM remodeling5,21. Bu nedenle, özellikle doğuştan Gelen SC rejeneratif kapasite ve ECM bağlı ipuçları arasındaki ilişkinin altında yatan mekanizmaları belirlemek için sonuçta sinir rejenerasyonu için bu kapasiteyi koşum içgörü için çok önemlidir.
Bu sorunu çözmek için, mekanik sertlik ve ligand tipinin fizyolojik olarak uygun aralıklarda kolayca ayarlanabildiği bir hücre kültürü alt katmanı üretmek için ayrıntılı bir metodoloji geliştirdik. Polidimethyl siloksan (PDMS) poliakrilamid jel ile karşılaştırıldığında son derece table mekaniği nedeniyle bir substrat olarak seçildi, maksimum Genç modülü yaklaşık 12 kPa yaklaşık 1000 kPa22,,,24PDMS tezat .23 Bu eldeki çalışma için yararlıdır, son çalışmalar bir tavşan siyatik sinir Young modülü göstermiştir gibi gelişme sırasında 50 kPa aşabilir, böylece PNS içinde sinirlerin sertlik aralığı daha önce incelenen daha geniş olduğunu düşündürmektedir. Farklı proteinler, mekanik ve ligandların SC davranışı nın kombinatoryal regülasyonlarını analiz etmek için PDMS yüzeyleri üzerine adsorpsiyon yapabilme yeteneğine sahiptir. Bu, PNS rejenerasyon sürecinde bulunan birden fazla mikroçevresel ipuçlarının araştırılmasına ve sadece25. Ayrıca, bu mühendislik hücre kültürü substratları immünohistokimya, batı lekeve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (q-PCR) gibi çok sayıda kantitatif analiz yöntemi ile uyumludur.
Bu tasarlanmış hücre kültürü platformu, her ECM’ye bağlı sinyalin bireysel ayarı yüksek düzeyde nedeniyle mekanistik yolları analiz etmek için son derece uygundur. Buna ek olarak, mikrotemas baskı da dahil olmak üzere hücre mikrodesenleme için popüler yöntemler, diğer ECM bağlı ipuçları 24 ile ilgili olarak hücre şeklini analiz etmek için kontrollü hücresel yapışma sağlamak için yüzeyler üzerinde elde edilebilir24. Bu çok önemlidir, çünkü hücre popülasyonlarında uzamayı teşvik eden çizgi desenli yüzeyler, sinir rejenerasyonu sırasında Büngner bantları içindeki uzamış ve rejeneratif SC’leri taklit etmek ve incelemek için bir araç sağlar. Ayrıca, hücresel morfoloji birden fazla hücre fonksiyonlarının güçlü bir düzenleyici ve potansiyel olarak26,,27kontrollü değilse şaşırtıcı deneysel sonuçlar tanıtabilir. ECM ipuçları28,29,,30tarafından düzenlenen olarak SC rejeneratif fenotip yöneten mekanizmalar şimdi önemli dikkat sağlanmaktadır. Bu PNS sinir rejenerasyonu yardım için sinir rehberlik kanalları olarak uygulanabilir biyomalzemelerin tasarımı içine fikir sağlamak için gereklidir. Bu ayrıntılı protokoller sonuçta ECM bağlı ipuçları tarafından düzenlenen SC ve diğer hücre tipi fonksiyonunun mekanizmaları deşifre etmek için potansiyel bir araç olarak uygulanabilir.
SCs onların phenotipik dönüşüm ve sinir yaralanması aşağıdaki rejeneratif potansiyel nedeniyle sinir rejenerasyonu teşvik edebilir. Ancak, ECM ipuçlarının bu rejeneratif kapasiteyi nasıl düzenlediği çoğunlukla belirsizliğini korumaktadır ve bu da sadece sinir rejenerasyonu yla ilgili biyomalzemelerin geliştirilmesini değil, aynı zamanda sinir yenilenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılmasını da engellemektedir. Bu etkileşimi incelemeye başlamak için, sertlik, protein kaplama ve yapışka…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar minnetle Cincinnati Üniversitesi’nden fon desteği kabul. Yazarlar da Ron Flenniken Cincinnati Üniversitesi Gelişmiş Malzeme Karakterizasyon laboratuvarı destek için teşekkür ederiz.
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |