Forberedelse af tunable ekstracellulære Matrix mikromiljøer til at evaluere Schwann Cell Fænotype Specifikation

Summary

Denne metode har til formål at illustrere de mekanismer, som ekstracellulære matrix signaler såsom substrat stivhed, protein sammensætning og celle morfologi regulere Schwann celle (SC) fænotype.

Abstract

Traumatisk perifert nervesystem (PNS) skader i øjeblikket mangler egnede behandlinger for at genvinde fuld funktionel opsving. Schwann celler (SCs), som de vigtigste gliaceller i PNS, spiller en afgørende rolle i at fremme PNS regenerering ved at dedifferentiating i en regenerativ celle fænotype efter skade. Den dedfferentierede tilstand af SC’er er imidlertid en udfordring at opretholde gennem den periode, der er nødvendig for regenerering, og påvirkes af ændringer i den omgivende ekstracellulære matrix (ECM). Det er derfor vigtigt at fastlægge det komplekse samspil mellem de økonomiske og sociale råd og forskellige ECM’er for at give tegn på, at de er et regenerativt potentiale i de største sikringsselskaber. For at løse dette problem blev der skabt en strategi, hvor forskellige ECM-proteiner blev adsorberet på et afstemmeligt polydimethylsiloxan (PDMS) substrat, som gav en platform, hvor stivhed og proteinsammensætning kan moduleres. SCs blev seedet på tunable substrater og kritiske cellulære funktioner, der repræsenterer dynamikken i SC fænotype blev målt. For at illustrere samspillet mellem SC protein udtryk og cellulære morfologi, forskellige såning tætheder af SCs ud over de enkelte mikrokontakt trykte cellulære mønstre blev udnyttet og karakteriseret ved immunfluorescens farvning og vestlige blot. Resultaterne viste, at celler med et mindre spredningsområde og en højere grad af cellulær forlængelse fremmede højere niveauer af SC-regenerative fænotypiske markører. Denne metode begynder ikke blot at optrævle det betydelige forhold mellem ECM og den cellulære funktion af SCs, men giver også retningslinjer for den fremtidige optimering af biomaterialer i perifernervereparation.

Introduction

Skader i det perifere nervesystem (PNS) er fortsat en stor klinisk udfordring i sundhedssektoren ved at bringe patienternes livskvalitet i livs og skabe en betydelig indvirkning gennem en lang række^{socioøkonomiske faktorer 1,2}. Schwann celler (SC), som de vigtigste gliaceller i PNS, giver de nødvendige molekylære og fysiske signaler til at fremkalde PNS regenerering og støtte i funktionelle inddrivelser i korte hul skader. Dette skyldes den bemærkelsesværdige evne til SCs at dedifferentiate i en “reparation” celle fænotype fra en myelinating eller Remak fænotype³. Reparationen SC er en karakteristisk celle fænotype på flere måder. Efter skade øger SCs deres spredningshastighed ved at genindtræde i cellecyklussen og begynde at udtrykke flere transskriptionelle faktorer for at lette reinnervation. Disse faktorer, såsom c-Jun og p75 NTR, er upregulated mens myelinating SC markører, såsom myelin grundlæggende protein (MBP), er downregulated^4,5. Desuden ændrer SCs morfologi til at blive aflange og tilpasset hinanden til at danne Büngner bands på tværs af skade site⁶. Dette giver en fysisk vejledningsmekanisme for axoner, der kan nå det korrekte distale mål⁷. Men på trods af den evne, som SCs besidder til at fremme nerve regenerering i korte hul skader, resultatet af funktionelle opsving er fortsat dårlig i alvorlige skader. Dette skyldes til dels et tab af ekstracellulære matrix (ECM) vejledning stikord, samt den manglende evne til SCs at opretholde den regenerative fænotype over lange perioder⁸.

Nerve regenerering og nyttiggørelse proces er tæt forbundet med tilstanden af basal lamina efter skade. Den basal lamina er et lag af ECM omkring nerven, der letter vejledning og giver ECM-bundet signaler for axoner og SCS i tilfælde, hvor det forbliver intakt efter skade⁹. ECM’s tilstand og dens evne til at levere matrixbundne signaler til celler er af afgørende betydning og er tidligere blevet undersøgt i en række forskellige sammenhænge^{10,11,12,13,14}. F.eks. har det vist sig , at ECM’s stivhed kan styre cellefunktioner som spredning og differentiering^11,15,16. EcM’s sammensætning kan også føre til en særskilt cellulær respons og regulere celleadfærd såsom migration og differentiering gennem intracellulære signalveje^17,18. Desuden spiller cellemorfologi, herunder spredningsområde og cellulær forlængelse, en vigtig rolle i reguleringen af funktionen og kan styres af ECM-bundne signaler^19,20. Mange tidligere undersøgelser har fokuseret på stamceller differentiere i definerede slægter, men SCs besidder en lignende evne til at ændre fænotype fra en homeostatisk, voksen SC inden for en sund nerve, til en reparation SC stand til at udskille proteiner og vækstfaktorer, mens remodeling ECM efter nerveskade^5,21. Derfor er det især afgørende at identificere mekanismer, der ligger til grund for forholdet mellem den medfødte SC-regenerative kapacitet og ECM-bundne signaler for indsigten i i sidste ende at udnytte denne kapacitet til nerveregenerering.

For at løse dette problem har vi udviklet en detaljeret metode til at producere et cellekultursubstrat, hvor mekanisk stivhed og ligandtype let kan indstilles i fysiologisk relevante intervaller. Polydimethyl siloxane (PDMS) blev valgt som substrat på grund af dets meget afstemmelige mekanik sammenlignet med polyacrylamidge, hvor den maksimale Youngs modulus er omkring 12 kPa i modsætning til PDMS på omkring 1000 kPa^22,23,24. Dette er til gavn for det arbejde ved hånden, som de seneste undersøgelser har vist Young’s modulus af en kanin iskiasnerven kan overstige 50 kPa under udvikling, hvilket tyder på, at rækken af stivhed af nerver i PNS er bredere end tidligere undersøgt. Forskellige proteiner er i stand til adsorption på PDMS substrater til at analysere kombinatoriske regulering af mekanik og ligander på SC adfærd. Dette gør det muligt at undersøge flere mikromiljøsignaler i PNS-regenereringsprocessen og sammenligne en høj grad af tunabilitet i forhold til det arbejde, der udelukkende fokuserer på substratets^{stivhed 25}. Endvidere er disse konstruerede cellekultursubstrater kompatible med en lang række kvantitative analysemetoder såsom immunhistokemi, western blot og kvantitativ polymerasekædereaktion (q-PCR).

Denne udviklede cellekulturplatform er særdeles velegnet til at analysere mekanistiske veje på grund af det høje niveau af individuel tunabilitet af hvert ECM-bundet signal. Desuden kan populære metoder til celle mikropatterning, herunder microcontact udskrivning, opnås på substraterne for at give mulighed for kontrolleret cellulære vedhæftning til at analysere celleform i forhold til andre ECM bundet signaler²⁴. Dette er kritisk, fordi linjemønstrede substrater, som fremmer forlængelse i cellepopulationer, giver et værktøj til at efterligne og studere aflange og regenerative SCs i Büngner bands under nerve regenerering. Endvidere, cellulære morfologi er en potent regulator af flere celle funktioner og kan potentielt indføre confounding eksperimentelle^resultater,hvis ikke^{kontrolleret 26},²⁷. Der lægges nu stor vægt på de mekanismer , der styrer VK-fenæntypen , som er reguleret af ECM-stikord^28,29,30. Dette er vigtigt at give indsigt i udformningen af biomaterialer, der kan anvendes som nerve vejledning ledninger til støtte i PNS nerve regenerering. Disse detaljerede protokoller kan i sidste ende anvendes som et potentielt redskab til at dechifrere mekanismerne i SC og andre celletype funktion som reguleret af ECM bundet stikord.

Protocol

1. Tunable cellekultur substrat forberedelse og karakterisering Forberedelse af substrat PDMS-basiselastomer- og hærdningsmidlerne blandes kraftigt ved hjælp af en pipettespids i et forhold mellem 10:1 og 60:1, indtil boblerne er homogent spredt i blandingen. Fjern bobler ved hjælp af vakuumtørring, indtil boblerne spredes.BEMÆRK: Under PDMS polymerisering, hærdning agent crosslinks med basen elastomer til at give endelige polymer ønskede mekaniske egenskaber. Crosslink-for…

Representative Results

For at analysere og kvantificere samspillet mellem substratstivhed og proteinsammensætning på SC-fænotype blev der udviklet et afstemmeligt PDMS-cellekultursubstrat (figur 1A). Kompressionstest af polymeren ved forskellig base: hærdende middelforhold blev anvendt til at kvantificere Youngs modulus (E) af substratet (Figur 1B). Det resulterende interval af modulværdier repræsenterer fysiologisk relevante substratbetingelser. Efter fremstilling af substrater…

Discussion

SCs kan fremme nerve regenerering på grund af deres fænotypiske transformation og regenerativt potentiale efter nerveskade. Men, hvordan ECM signaler regulere denne regenerative kapacitet forbliver for det meste uklart, potentielt hindrer ikke kun udviklingen af biomaterialer, der har til formål at fremme nerve regenerering, men også forståelsen af de mekanismer, der er involveret i nerve regenerering. For at begynde at undersøge dette samspil, cellekultur substrater blev skabt, hvor ECM signaler såsom stivhed, pr…

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate	Thermo Fisher Scientific	A23017	BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076S	Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074S	Antibody used for western blot analysis
BrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	B35130	Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	Protein used to coat coverslips
Compression force test machine	TestResources		Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Cell culture medium supplemental
Fibronectin	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti2	Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78440	Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36971	Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody	Thermo Fisher Scientific	711202	Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody	Cell Signaling Technology	3700S	Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	Photoresist
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody	Cell Signaling Technology	9165S	Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody	Abcam	ab40390	Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody	Cell Signaling Technology	8238S	Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer	Abcam	ab156034	Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line	ATCC	CRL-2768	Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent	Sigma Aldrich	761036	Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	15090-046	Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner	Novascan		Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	Cell dissociation reagent