JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

Published: June 02, 2020
doi:
10.3791/61496
, ,
1Department of Chemical and Environmental Engineering,University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering,University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Deze methodologie heeft tot doel de mechanismen te illustreren waarmee extracellulaire matrixsignalen zoals substraatstijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie het fenotype van Schwann-cel (SC) reguleren.

Abstract

Traumatisch perifeer zenuwstelsel (PNS) verwondingen momenteel gebrek aan geschikte behandelingen om volledig functioneel herstel te herwinnen. Schwann cellen (SCs), als de belangrijkste gliacellen van de PNS, spelen een vitale rol bij het bevorderen van PNS regeneratie door dedifferentiatie in een regeneratieve cel fenotype na letsel. De gededifferentieerde toestand van SC’s is echter een uitdaging om de periode die nodig is voor regeneratie te handhaven en wordt beïnvloed door veranderingen in de omringende extracellulaire matrix (ECM). Daarom is het bepalen van het complexe samenspel tussen SC’s en verschillende ECM om signalen te geven van regeneratief potentieel van SC’s. Om dit aan te pakken werd een strategie ontwikkeld waarbij verschillende ECM-eiwitten werden geadsorbeerd op een tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substraat dat een platform bood waar stijfheid en eiwitsamenstelling kunnen worden gemoduleerd. SC’s werden gezaaid op de tunable substraten en kritische cellulaire functies die de dynamiek van SC fenotype werden gemeten. Ter illustratie van het samenspel tussen SC eiwitexpressie en cellulaire morfologie, verschillende zaaien dichtheden van SCs in aanvulling op individuele microcontact gedrukte cellulaire patronen werden gebruikt en gekenmerkt door immunofluorescentie vlekken en westerse vlek. De resultaten toonden aan dat de cellen met een kleiner uitspreiden gebied en hogere omvang van cellulaire verlenging hogere niveaus van SC regeneratieve fenotypictellers bevorderden. Deze methodologie begint niet alleen de significante relatie tussen de ECM en de cellulaire functie van SCs te ontrafelen, maar biedt ook richtlijnen voor de toekomstige optimalisatie van biomaterialen in perifere zenuwreparatie.

Introduction

Perifere verwondingen van het zenuwstelsel (PNS) blijven een belangrijke klinische uitdaging in de gezondheidszorg door de kwaliteit van leven voor patiënten in gevaar te brengen en een significante impact te creëren door een veelheid van sociaal-economische factoren1,2. Schwann cellen (SC), als de belangrijkste gliacellen in de PNS, bieden de nodige moleculaire en fysieke signalen om PNS regeneratie te induceren en hulp bij functionele herstel in korte hiaatletsels. Dit is te wijten aan het opmerkelijke vermogen van SCs om te dedifferentiaat in een “reparatie” cel fenotype van een myelineerend of Remak fenotype3. De repair SC is een onderscheidend celfenotype op verschillende manieren. Na letsel verhogen SC’s hun proliferatiesnelheid door de celcyclus opnieuw in te voeren en verschillende transcriptiefactoren uit te voeren om de reinnervatie te vergemakkelijken. Deze factoren, zoals c-Jun en p75 NTR, zijn upregulated terwijl myelinating SC markers, zoals myeline basiseiwit (MBP), zijn downregulated4,5. Bovendien veranderen SCs morfologie om langwerpig te worden en met elkaar uitgelijnd om Büngner-banden te vormen over de letselplaats6. Dit biedt een fysiek geleidingsmechanisme voor de axonen uit te breiden tot de juiste distale doelstelling7. Echter, ondanks het vermogen dat SCs bezitten om zenuwregeneratie te bevorderen in korte kloof verwondingen, het resultaat van functioneel herstel blijft slecht in ernstige verwondingen. Dit is deels te wijten aan een verlies van extracellulaire matrix (ECM) begeleidingssignalen, evenals het onvermogen van SCs om het regeneratieve fenotype gedurende langere perioden te behouden8.

De zenuwregeneratie en het herstelproces zijn nauw verbonden met de toestand van de basale lamina na letsel. De basale lamina is een laag ECM rond de zenuw die begeleiding vergemakkelijkt en biedt ECM-gebonden signalen voor axonen en SCs in gevallen waarin het intact blijft na letsel9. De toestand van de ECM en het vermogen om matrixgebonden signalen aan cellen te leveren is van vitaal belang en is eerder onderzocht in verschillende contexten10,11,12,13,14. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat de stijfheid van de ECM celfuncties zoals proliferatie endifferentiatie 11,15,16kan leiden . Samenstelling van de ECM kan ook leiden tot een duidelijke cellulaire respons en reguleren van celgedrag zoals migratie en differentiatie door middel van intracellulaire signalering trajecten17,18. Bovendien spelen celmorfologie, met inbegrip van verspreidingsgebied en cellulaire verlenging, een belangrijke rol bij het reguleren van de functie en kan worden beheerst door ECM-gebonden signalen19,20. Veel eerdere studies hebben zich gericht op stamcellen die zich onderscheiden in gedefinieerde afstammingen, maar SC’s beschikken over een vergelijkbaar vermogen om fenotype te veranderen van een homeostatische, volwassen SC binnen een gezonde zenuw, tot een reparatie SC die eiwitten en groeifactoren kan afscheiden tijdens het verbouwen van de ECM na zenuwletsel5,21. Daarom is het vooral van cruciaal belang om mechanismen te identificeren die ten grondslag liggen aan de relatie tussen de aangeboren SC-regeneratieve capaciteit en ECM-gebonden signalen voor het inzicht om deze capaciteit uiteindelijk te benutten voor zenuwregeneratie.

Om dit aan te pakken, hebben we een gedetailleerde methodologie ontwikkeld om een celkubstraat te produceren waar mechanische stijfheid en ligand type gemakkelijk kunnen worden afgestemd in fysiologisch relevante bereiken. Polydimethyl siloxaan (PDMS) werd gekozen als substraat vanwege de zeer tunable mechanica in vergelijking met polyacrylamide gel, waar de maximale Young’s modulus is ongeveer 12 kPa in tegenstelling tot PDMS op ongeveer 1000 kPa22,23,24. Dit is gunstig voor het werk bij de hand, als recente studies hebben aangetoond dat de Young modulus van een konijn heupzenuw kan meer dan 50 kPa tijdens de ontwikkeling, waardoor suggereert dat het bereik van stijfheid van de zenuwen binnen de PNS is breder dan eerder onderzocht. Verschillende eiwitten zijn in staat om te adsorpteren op PDMS substraten om de combinatorische regulatie van mechanica en liganden op SC gedrag te analyseren. Dit maakt het mogelijk om meerdere micro-milieusignalen te onderzoeken die aanwezig zijn in het PNS-regeneratieproces en een vergelijking van een hoge mate van tunability met het werk dat zich uitsluitend richt op stijfheid van het substraat25. Verder zijn deze ontworpen celkweeksubstraten compatibel met een veelheid aan kwantitatieve analysemethoden zoals immunohistochemie, westelijke vlek en kwantitatieve polymerasekettingreactie (q-PCR).

Dit ontworpen celcultuurplatform is zeer geschikt voor het analyseren van mechanistische paden vanwege het hoge niveau van individuele tunability van elk ECM-gebonden signaal. Bovendien kunnen populaire methoden voor celmicropatterning, inclusief microcontactafdrukken, worden bereikt op de substraten om gecontroleerde cellulaire hechting mogelijk te maken om de celvorm te analyseren ten opzichte van andere ECM-gebonden signalen24. Dit is van cruciaal belang omdat lijn patroon substraten, die de verlenging in celpopulaties te bevorderen, bieden een hulpmiddel om na te bootsen en te bestuderen langwerpige en regeneratieve SCs binnen Büngner bands tijdens zenuwregeneratie. Verder, cellulaire morfologie is een krachtige regulator van meerdere celfuncties en kan mogelijk leiden tot verstorende experimentele resultaten, zo niet gecontroleerd26,27. Er wordt nu veel aandacht besteed aan de mechanismen voor het regeneratieve fenotype van de SC, zoals geregeld door ECM-signalen28,29,30. Dit is essentieel om inzicht te geven in het ontwerp van biomaterialen die kunnen worden toegepast als zenuwgeleidingsleidingen voor hulp bij PNS zenuwregeneratie. Deze gedetailleerde protocollen kunnen uiteindelijk worden toegepast als een potentieel instrument om de mechanismen van SC en andere celtypefunctie te ontcijferen zoals gereguleerd door ECM-gebonden signalen.

Protocol

1. Tunable celcultuur substraat voorbereiding en karakterisering Substraatbereiding Meng het PDMS-basiselastome en uithardingsmiddel met behulp van een pipetpunt krachtig bij een verhouding tussen 10:1 en 60:1 tot bellen homogeen verspreid zijn in het mengsel. Verwijder bellen met behulp van vacuüm uitdroging totdat bellen worden afgevoerd.OPMERKING: Tijdens PDMS polymerisatie, uithardingsmiddel crosslinks met de basis elastomeer om de uiteindelijke polymeer gewenste mechanische …

Representative Results

Om het samenspel tussen substraatstijfheid en eiwitsamenstelling op SC-fenotype te analyseren en te kwantificeren, werd een tunable PDMS-celkubstraat ontwikkeld(figuur 1A). Compressietesten van het polymeer op verschillende basis: de verhoudingen van het uithardingsmiddel werden gebruikt om de modulus (E) van de Young (E) van het substraat te kwantificeren (figuur 1B). Het resulterende bereik van moduluswaarden vertegenwoordigt fysiologisch relevante substraatco…

Discussion

SCs kunnen bevorderen zenuwregeneratie als gevolg van hun fenotypische transformatie en regeneratieve potentieel na zenuwletsel. Echter, hoe ECM cues reguleren deze regeneratieve capaciteit blijft meestal onduidelijk, potentieel belemmeren niet alleen de ontwikkeling van biomaterialen die gericht zijn op zenuwregeneratie te bevorderen, maar ook het begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij zenuwregeneratie. Om te beginnen met dit samenspel te onderzoeken, celkweek substraten werden gemaakt waar ECM cues zoals stij…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen dankbaar de financiering steun van de Universiteit van Cincinnati. De auteurs bedanken ook Ron Flenniken van de Universiteit van Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratorium voor ondersteuning.

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior – Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engenharia. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Tags

Keywords: Extracellular MatrixMicroenvironmentSchwann CellCell PhenotypePDMSMicrocontact PrintingSubstrate StiffnessProtein CompositionCell MorphologyNervous System RegenerationCell Culture Platform
check_url/pt/61496?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image