Préparation des microenvironnements de matrice extracellulaire tunable pour évaluer les spécifications du phénotype de cellules de Schwann
Summary
Cette méthodologie vise à illustrer les mécanismes par lesquels les signaux de matrice extracellulaire tels que la rigidité du substrat, la composition des protéines et la morphologie cellulaire régulent le phénotype des cellules Schwann (SC).
Abstract
Les blessures du système nerveux périphérique traumatique (PNS) manquent actuellement de traitements appropriés pour retrouver le rétablissement fonctionnel complet. Les cellules schwann (SC), en tant que principales cellules gliales du PNS, jouent un rôle vital dans la promotion de la régénération du PNS en dédifférantiant en un phénotype de cellules régénératrices à la suite d’une blessure. Cependant, l’état dédifférencié des SC est difficile à maintenir pendant la période de temps nécessaire à la régénération et est affecté par les changements dans la matrice extracellulaire environnante (ECM). Par conséquent, il est essentiel de déterminer l’interaction complexe entre les CSC et les DIFFÉRENTS CPE pour fournir des indices de potentiel régénérateur des SC. Pour remédier à cette situation, une stratégie a été créée où différentes protéines ECM ont été adsorées sur un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) tunable qui a fourni une plate-forme où la rigidité et la composition des protéines peuvent être modulées. Les SC ont été ensemencés sur les substrats tunables et des fonctions cellulaires critiques représentant la dynamique du phénotype sc ont été mesurées. Pour illustrer l’interaction entre l’expression des protéines SC et la morphologie cellulaire, les différentes densités d’ensemencement des SC en plus des modèles cellulaires imprimés individuels de microcontact ont été utilisées et caractérisées par la coloration d’immunofluorescence et la tache occidentale. Les résultats ont montré que les cellules avec une plus petite zone de propagation et une plus grande étendue de l’élongation cellulaire ont favorisé des niveaux plus élevés de marqueurs phénotypiques régénératifs de SC. Cette méthodologie commence non seulement à démêler la relation significative entre l’ECM et la fonction cellulaire des SC, mais fournit également des lignes directrices pour l’optimisation future des biomatériaux dans la réparation des nerfs périphériques.
Introduction
Les blessures du système nerveux périphérique (PNS) demeurent un défi clinique majeur dans les soins de santé en compromettant la qualité de vie des patients et en créant un impact significatif à travers une multitude de facteurs socio-économiques1,2. Les cellules de Schwann (SC), en tant que principales cellules gliales du PNS, fournissent les indices moléculaires et physiques nécessaires pour induire la régénération de PNS et aident aux rétablissements fonctionnels dans les blessures à court écart. Cela est dû à la capacité remarquable des SC de dédifférentier dans un phénotype cellulaire de « éparatio » à partir d’un phénotype myélin ou remak3. La réparation SC est un phénotype cellulaire distinctif de plusieurs façons. Après dommage, les SC augmentent leur taux de prolifération en réintant le cycle cellulaire et commencent l’expression de plusieurs facteurs transcriptionnels pour faciliter la réinnervation. Ces facteurs, tels que c-Jun et p75 NTR, sont upregulated tandis que les marqueurs de SC myélinants, tels que la protéine de base de myéline (MBP), sont downregulated4,5. En outre, les SC changent de morphologie pour qu’ils s’allongent et s’alignent les uns avec les autres pour former des bandes de Büngner sur le site de la blessure6. Cela fournit un mécanisme de guidage physique pour les axones à s’étendre à la cible distale correcte7. Cependant, en dépit de la capacité que les SC possèdent pour favoriser la régénération de nerf dans les dommages courts d’écart, le résultat de la récupération fonctionnelle reste pauvre dans les dommages graves. Cela est dû en partie à la perte de signaux d’orientation de matrice extracellulaire (ECM), ainsi qu’à l’incapacité des SC à maintenir le phénotype régénératif sur de longues périodes de temps8.
Le processus de régénération et de récupération des nerfs sont intimement liés à l’état de la lamina basale suite à une blessure. La lamina basale est une couche d’ECM autour du nerf qui facilite l’orientation et fournit des indices liés à l’ECM pour les axones et les SC dans les cas où il reste intact à la suite d’une blessure9. L’état de l’ECM et sa capacité à fournir des signaux liés à la matrice aux cellules est d’une importance vitale et a déjà été exploré dans une variété de contextes différents10,11,12,13,14. Par exemple, il a été démontré que la rigidité de l’ECM peut guider les fonctions cellulaires telles que la prolifération et la différenciation11,15,16. La composition de l’ECM peut également conduire à une réponse cellulaire distincte et réguler les comportements cellulaires tels que la migration et la différenciation par les voies de signalisationintracellulaires 17,18. En outre, la morphologie cellulaire, y compris la zone d’épandage et l’allongement cellulaire, jouent un rôle majeur dans la régulation de la fonction et peuvent être régies par des signaux liés à l’ECM19,20. De nombreuses études antérieures se sont concentrées sur les cellules souches différenciant en lignées définies, mais les SC possèdent une capacité similaire de modifier le phénotype d’un SC homéostatique et adulte dans un nerf sain, à un SC de réparation capable de sécréter des protéines et des facteurs de croissance tout en remodelant l’ECM suite à une lésion nerveuse5,21. Par conséquent, il est particulièrement crucial d’identifier les mécanismes sous-jacents à la relation entre la capacité régénératrice innée sc et les indices liés ECM pour la perspicacité d’exploiter en fin de compte cette capacité de régénération nerveuse.
Pour remédier à cette situation, nous avons développé une méthodologie détaillée pour produire un substrat de culture cellulaire où la rigidité mécanique et le type de ligand peuvent être facilement réglés dans des gammes physiologiquement pertinentes. Polydiméthyl siloxane (PDMS) a été choisi comme substrat en raison de sa mécanique très tunable par rapport au gel polyacrylamide, où le module maximum de Young est d’environ 12 kPa contrasté à PDMS à environ 1000 kPa22,23,24. Ceci est bénéfique pour le travail à portée de main, comme des études récentes ont montré le module du jeune d’un nerf sciatique lapin peut dépasser 50 kPa pendant le développement, ce qui suggère que la gamme de rigidité des nerfs dans le PNS est plus large que précédemment examiné. Différentes protéines sont capables d’adsorption sur les substrats PDMS pour analyser la régulation combinatoire de la mécanique et des ligands sur le comportement SC. Cela permet d’enquêter sur plusieurs indices microenvironnementaux présents dans le processus de régénération du PNS et de comparer un degré élevé de thonilité au travail axé uniquement sur la rigidité du substrat25. De plus, ces substrats de culture cellulaire conçus sont compatibles avec une multitude de méthodes d’analyse quantitative telles que l’immunohistochimie, la tache occidentale et la réaction quantitative en chaîne de polymérase (q-PCR).
Cette plate-forme de culture cellulaire conçue est très appropriée pour analyser les voies mécanistes en raison du niveau élevé de thonabilité individuelle de chaque signal lié à l’ECM. En outre, des méthodes populaires pour le micropatternage cellulaire, y compris l’impression de microcontacts, peuvent être réalisées sur les substrats pour permettre l’adhérence cellulaire contrôlée pour analyser la forme cellulaire par rapport à d’autres signaux liés ECM24. Ceci est essentiel parce que les substrats à motifs de lignée, qui favorisent l’allongement dans les populations cellulaires, fournissent un outil pour imiter et étudier les SC allongés et régénératifs dans les bandes de Büngner pendant la régénération nerveuse. En outre, la morphologie cellulaire est un puissant régulateur des fonctions cellulaires multiples et peut potentiellement introduire des résultats expérimentaux confondants si elle n’est pas contrôlée26,27. Une attention particulière est maintenant accordée aux mécanismes régissant le phénotype régénératif sc tel que réglementé par les indices ECM28,29,30. Ceci est essentiel pour fournir un aperçu de la conception des biomatériaux qui peuvent être appliqués comme conduits d’orientation nerveuse pour l’aide dans la régénération des nerfs PNS. Ces protocoles détaillés peuvent finalement être appliqués comme un outil potentiel pour déchiffrer les mécanismes de sc et d’autres fonctions de type de cellule telles que réglées par les indices liés ecm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les SC peuvent favoriser la régénération nerveuse en raison de leur transformation phénotypique et de leur potentiel régénérateur à la suite d’une lésion nerveuse. Cependant, la façon dont les indices ECM régulent cette capacité régénératrice reste pour la plupart floue, ce qui pourrait entraver non seulement le développement de biomatériaux qui visent à promouvoir la régénération des nerfs, mais aussi la compréhension des mécanismes impliqués dans la régénération nerveuse. Pour commencer à …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de l’Université de Cincinnati. Les auteurs remercient également Ron Flenniken du laboratoire de caractérisation des matériaux avancés de l’Université de Cincinnati pour son soutien.
Materials
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
| BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
| BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
| Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
| Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
| Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
| Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
| Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
| Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
| Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
| Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
| Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
| Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
| RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
| SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
| UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
| Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |
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