Utarbeidelse av justerbare ekstracellulære matrisemikromiljøer for å evaluere Schwann Cell Phenotype Specification

Summary

Denne metodikken tar sikte på å illustrere mekanismene som ekstracellulære matrisesignaler som substratstivhet, proteinsammensetning og cellemorfologi regulerer Schwann celle (SC) fenotype.

Abstract

Traumatiske perifere nervesystemet (PNS) skader mangler for tiden egnede behandlinger for å gjenvinne full funksjonell gjenoppretting. Schwann celler (SCs), som de viktigste glial cellene i PNS, spiller en viktig rolle i å fremme PNS regenerering ved å dedifferentiating inn i en regenerativ celle fenotype etter skade. Den avdifferentiated tilstanden til SCer er imidlertid utfordrende å opprettholde gjennom tidsperioden som trengs for regenerering og påvirkes av endringer i den omkringliggende ekstracellulære matrisen (ECM). Derfor er det viktig å bestemme det komplekse samspillet mellom SCer og ulike ECM for å gi signaler om regenerativt potensial for SCer. For å løse dette ble det opprettet en strategi der forskjellige ECM-proteiner ble adsorbert på et tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrat som ga en plattform der stivhet og proteinsammensetning kan moduleres. SCer ble seedet på de justerbare substratene og kritiske cellulære funksjoner som representerer dynamikken i SC-fenotype ble målt. For å illustrere samspillet mellom SC protein uttrykk og cellulær morfologi, ulike seeding tettheter av SCs i tillegg til individuelle mikrokontakt trykte cellulære mønstre ble benyttet og preget av immunofluorescens farging og vestlige blot. Resultatene viste at celler med et mindre spredningsområde og høyere grad av cellulær forlengelse fremmet høyere nivåer av SC regenerative fenotypiske markører. Denne metodikken begynner ikke bare å løse det betydelige forholdet mellom ECM og cellulær funksjon av SCer, men gir også retningslinjer for fremtidig optimalisering av biomaterialer i perifer nervereparasjon.

Introduction

Perifere nervesystemet (PNS) skader forblir en stor klinisk utfordring i helsevesenet ved å kompromittere livskvaliteten for pasienter og skape en betydelig innvirkning gjennom en rekke sosioøkonomiske faktorer^1,,2. Schwann celler (SC), som de viktigste glial cellene i PNS, gir nødvendige molekylære og fysiske signaler for å indusere PNS regenerering og hjelp til funksjonelle gjenopprettinger i korte gap skader. Dette skyldes den bemerkelsesverdige evnen til SCs å avdifferentiate i en “reparasjon” celle fenotype fra en myelinating eller Remak fenotype³. Reparasjons-SC er en særegen cellefenotype på flere måter. Etter skade øker SCer spredningsraten ved å gå inn i cellesyklusen igjen og begynne uttrykk for flere transkripsjonelle faktorer for å lette gjeninnjevning. Disse faktorene, for eksempel c-Jun og p75 NTR, er upregulert mens myelinating SC markører, for eksempel myelin grunnleggende protein (MBP), er downregulert^4,5. I tillegg endrer SCs morfologi til å bli langstrakt og på linje med hverandre for å danne Büngner-bånd over skadestedet⁶. Dette gir en fysisk veiledningsmekanisme for at aksonene skal utvides til riktig distal mål⁷. Men til tross for evnen som SCs har til å fremme nerveregenerering i korte gapskader, er utfallet av funksjonell gjenoppretting fortsatt dårlig i alvorlige skader. Dette skyldes delvis tap av ekstracellulære matrise (ECM) veiledningssignaler, samt manglende evne til SCer for å opprettholde den regenerative fenotypen over lange perioder⁸.

Nerveregenerering og gjenopprettingsprosessen er nært knyttet til tilstanden til basal lamina etter skade. Basal lamina er et lag av ECM rundt nerven som letter veiledning og gir ECM-bundne signaler for aksoner og SCer i tilfeller der det forblir intakt etter skade⁹. Tilstanden til ECM og dens evne til å levere matrisebundne signaler til celler er svært viktig og har tidligere blitt utforsket i en rekke forskjellige sammenhenger^{10,11,12,13,14}. Det har for eksempel vist seg at stivheten i ECM kan veilede cellefunksjoner som spredning og differensiering^11,,15,,16. Sammensetning av ECM kan også føre til en distinkt cellulær respons og regulere celleatferd som migrering og differensiering gjennom intracellulære signalveier^17,18. Videre spiller cellemorfologi, inkludert spredningsområde og cellulær forlengelse, en viktig rolle i reguleringen av funksjonen og kan styres av ECM-bundne signaler^19,20. Mange tidligere studier har fokusert på stamceller som differensierer til definerte linjer, men SCs har en lignende evne til å endre fenotype fra en homeostatisk, voksen SC i en sunn nerve, til en reparasjon SC i stand til å skille ut proteiner og vekstfaktorer mens remodeling ECM etter nerveskade^5,21. Derfor er det spesielt viktig å identifisere mekanismer som ligger til grunn for forholdet mellom den medfødte SC regenerative kapasiteten og ECM-bundne signaler for innsikten til slutt å utnytte denne kapasiteten for nerveregenerering.

For å løse dette har vi utviklet en detaljert metodikk for å produsere et cellekultursubstrat der mekanisk stivhet og ligandtype lett kan justeres i fysiologisk relevante områder. Polydimetyl siloxane (PDMS) ble valgt som et substrat på grunn av sin svært tunable mekanikk sammenlignet med polyakrylamid gel, hvor den maksimale Youngs modulus er rundt 12 kPa i kontrast til PDMS på rundt 1000 kPa^22,23,24. Dette er gunstig for det forestående arbeidet, da nyere studier har vist at Youngs modulus av en kanin isjiasnerve kan overstige 50 kPa under utvikling, og dermed tyder på at omfanget av stivhet av nerver i PNS er bredere enn tidligere undersøkt. Ulike proteiner er i stand til adsorpsjon på PDMS-underlag for å analysere kombinatorisk regulering av mekanikk og ligander på SC-atferd. Dette gjør det mulig for undersøkelse av flere mikromiljøsignaler som finnes i PNS regenereringsprosessen og sammenligning av en høy grad av tunability til arbeidet med å fokusere utelukkende på stivhet i substratet²⁵. Videre er disse konstruerte cellekultursubstratene kompatible med en rekke kvantitative analysemetoder som immunohistochemistry, vestlig blot og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (q-PCR).

Denne konstruerte cellekulturplattformen er svært egnet for å analysere mekanistiske veier på grunn av det høye nivået av individuell tunability av hvert ECM-bundet signal. I tillegg kan populære metoder for cellemikring, inkludert mikrokontaktutskrift, oppnås på substratene for å tillate kontrollert cellulær vedheft å analysere celleform i forhold til andre ECM-bundne signaler²⁴. Dette er avgjørende fordi linjemønstrede substrater, som fremmer forlengelse i cellepopulasjoner, gir et verktøy for å etterligne og studere langstrakte og regenerative SCer i Büngner-bånd under nerveregenerering. Videre er cellulær morfologi en potent regulator av flere cellefunksjoner og kan potensielt introdusere forvirrende eksperimentelle resultater hvis ikke kontrollert^26,27. Det gis nå betydelig oppmerksomhet til mekanismene som styrer SC regenerativ fenotype som regulert av ECM-signaler^28,,29,,30. Dette er viktig for å gi innsikt i utformingen av biomaterialer som kan brukes som nerveveiledningskanaler for hjelp i PNS nerveregenerering. Disse detaljerte protokollene kan til slutt brukes som et potensielt verktøy for å dechiffrere mekanismene til SC og annen celletypefunksjon som regulert av ECM-bundne signaler.

Protocol

1. Tunable celle kultur substrat forberedelse og karakterisering Substrat forberedelse Bland PDMS base elastomer og herdingsmidler ved hjelp av en pipettespiss kraftig i forholdet mellom 10:1 og 60:1 til boblene er homogent dispergert i blandingen. Fjern bobler ved hjelp av vakuumtørke til bobler forsvinner.MERK: Under PDMS polymerisering, herding agent krysskoblinger med basen elastomer for å gi endelig polymer ønskede mekaniske egenskaper. Crosslink-forhold kan justeres for ?…

Representative Results

For å analysere og kvantifisere samspillet mellom substratstivhet og proteinsammensetning på SC-fenotype, ble det utviklet et tunable PDMS cellekultursubstrat (figur 1A). Kompresjonstesting av polymeren ved forskjellig base: herdingsmiddelforhold ble benyttet til å kvantifisere Youngs modulus (E) av substratet (Figur 1B). Det resulterende utvalget av modulære verdier representerer fysiologisk relevante substratforhold. Etter utarbeidelse av substrater ble SC…

Discussion

SCs kan fremme nerve regenerering på grunn av deres fenotypiske transformasjon og regenerative potensial etter nerveskade. Men hvordan ECM-signaler regulerer denne regenerative kapasiteten forblir for det meste uklar, noe som potensielt hindrer ikke bare utviklingen av biomaterialer som tar sikte på å fremme nerveregenerering, men også forståelsen av mekanismene som er involvert i nerveregenerering. For å begynne å undersøke dette samspillet, ble cellekultur substrater opprettet der ECM-signaler som stivhet, prot…

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate	Thermo Fisher Scientific	A23017	BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076S	Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074S	Antibody used for western blot analysis
BrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	B35130	Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	Protein used to coat coverslips
Compression force test machine	TestResources		Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Cell culture medium supplemental
Fibronectin	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti2	Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78440	Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36971	Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody	Thermo Fisher Scientific	711202	Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody	Cell Signaling Technology	3700S	Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	Photoresist
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody	Cell Signaling Technology	9165S	Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody	Abcam	ab40390	Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody	Cell Signaling Technology	8238S	Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer	Abcam	ab156034	Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line	ATCC	CRL-2768	Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent	Sigma Aldrich	761036	Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	15090-046	Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner	Novascan		Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	Cell dissociation reagent