Preparação de Microambientes de Matriz Extracelular Incapaz para avaliar especificação de fenótipo celular schwann

Summary

Esta metodologia visa ilustrar os mecanismos pelos quais pistas de matriz extracelular, como rigidez do substrato, composição de proteínas e morfologia celular regulam o fenótipo de células schwann (SC).

Abstract

Atualmente, as lesões traumáticas do sistema nervoso periférico (PNS) não possuem tratamentos adequados para recuperar a recuperação funcional completa. As células schwann (SCs), como as principais células gliais da PNS, desempenham um papel vital na promoção da regeneração da PNS, dediferindo-se em um fenótipo celular regenerativo após a lesão. No entanto, o estado dediferenciado das SCs é desafiador para manter-se durante o período de tempo necessário para a regeneração e é impactado por mudanças na matriz extracelular circundante (ECM). Portanto, determinar a interação complexa entre SCs e ECM diferente para fornecer pistas de potencial regenerativo das SCs é essencial. Para lidar com isso, foi criada uma estratégia onde diferentes proteínas ECM foram adsorvidas em um substrato de polidimetilatilaxitano (PDMS) que forneceu uma plataforma onde a rigidez e a composição proteica podem ser moduladas. As SCs foram semeadas nos substratos tunable e foram medidas funções celulares críticas que representam a dinâmica do fenótipo de SC. Para ilustrar a interação entre a expressão proteica SC e a morfologia celular, foram utilizadas diferentes densidades de semeadura de SCs, além de padrões celulares impressos em microcontatos individuais e caracterizados pela coloração da imunofluorescência e mancha ocidental. Os resultados mostraram que as células com menor área de disseminação e maior extensão do alongamento celular promoveram níveis mais elevados de marcadores fenotípicos regenerativos de SC. Essa metodologia não só começa a desvendar a relação significativa entre o ECM e a função celular das SCs, mas também fornece diretrizes para a otimização futura de biomateriais na reparação do nervo periférico.

Introduction

As lesões do sistema nervoso periférico (PNS) continuam sendo um grande desafio clínico na saúde, comprometendo a qualidade de vida dos pacientes e criando um impacto significativo através de uma infinidade de fatores socioeconômicos^1,2. As células schwann (SC), como as principais células gliais da PNS, fornecem sinais moleculares e físicos necessários para induzir a regeneração da PNS e auxiliar em recuperações funcionais em lesões de curto espaço. Isso se deve à notável capacidade dos SCs de dediferentes em um fenótipo celular de “reparação” de um fenótipo de mieliagem ou remak³. O reparo SC é um fenótipo celular distinto de várias maneiras. Após a lesão, as SCs aumentam sua taxa de proliferação reentrando no ciclo celular e iniciam a expressão de vários fatores transcricionais para facilitar a reinervação. Esses fatores, como c-Jun e p75 NTR, são regulados, enquanto os marcadores de SC de mielin, como a proteína básica de mielina (MBP), estão abaixo da regulação^4,,5. Além disso, os SCs mudam a morfologia para se alongarem e se alinharem entre si para formar bandas de Büngner em todo o local da lesão⁶. Isso fornece um mecanismo de orientação física para que os axônios se estendam até o alvo distal correto⁷. No entanto, apesar da capacidade que as SCs possuem para promover a regeneração nervosa em lesões de curto espaço de espaço, o resultado da recuperação funcional permanece ruim em lesões graves. Isso se deve, em parte, à perda de pistas de orientação da matriz extracelular (ECM), bem como à incapacidade das SCs de manter o fenótipo regenerativo por longos períodos de tempo⁸.

O processo de regeneração nervosa e recuperação estão intimamente ligados ao estado da lamina basal após lesão. A lamina basal é uma camada de ECM em torno do nervo que facilita a orientação e fornece pistas vinculadas ao ECM para axônios e SCs nos casos em que permanece intacta após a lesão⁹. O estado do ECM e sua capacidade de entregar pistas ligadas à matriz às células é de vital importância e já foi explorado anteriormente em uma variedade de diferentes contextos^{10,11,,12,,13,14}. Por exemplo, foi demonstrado que a rigidez do ECM pode orientar funções celulares como proliferação e diferenciação^11,,15,,16. A composição do ECM também pode levar a uma resposta celular distinta e regular comportamentos celulares como migração e diferenciação através de vias de sinalização intracelular^17,18. Além disso, a morfologia celular, incluindo a expansão da área e o alongamento celular, desempenham um papel importante na regulação da função e podem ser regidas pelas pistas vinculadas ao ECM^19,,20. Muitos estudos anteriores se concentraram em células-tronco que se diferenciam em linhagens definidas, mas as SCs possuem uma capacidade semelhante de alterar o fenótipo de um HOMEOSTático, adulto SC dentro de um nervo saudável, para um SC reparador capaz de segregar proteínas e fatores de crescimento enquanto remodelam o ECM após lesão nervosa^5,,21. Portanto, é especialmente crucial identificar mecanismos subjacentes à relação entre a capacidade regenerativa de SC inata e as pistas vinculadas ao ECM para que a percepção exaia essa capacidade de regeneração nervosa.

Para lidar com isso, desenvolvemos uma metodologia detalhada para produzir um substrato de cultura celular onde rigidez mecânica e tipo de ligante podem ser facilmente sintonizados em faixas fisiologicamente relevantes. O siloxano de polidimtil (PDMS) foi escolhido como substrato devido à sua mecânica altamente tíclica em comparação com o gel de poliacrilamida, onde o módulo máximo de Young é em torno de 12 kPa contrastado com PDMS em torno de 1000 kPa^22,23,,24. Isso é benéfico para o trabalho em questão, pois estudos recentes mostraram que o módulo de um nervo ciático de coelho pode exceder 50 kPa durante o desenvolvimento, sugerindo assim que a gama de rigidez dos nervos dentro da PNS é maior do que o examinado anteriormente. Diferentes proteínas são capazes de adsorção em substratos PDMS para analisar a regulação combinatória de mecânica e ligantes sobre o comportamento de SC. Isso permite a investigação de múltiplas pistas microambientais presentes no processo de regeneração da PNS e comparação de um alto grau de sintonia com o trabalho com foco apenas na rigidez do substrato²⁵. Além disso, esses substratos de cultura celular projetada são compatíveis com uma infinidade de métodos de análise quantitativa, como imunohistoquímica, mancha ocidental e reação quantitativa em cadeia de polimerase (q-PCR).

Esta plataforma de cultura celular projetada é altamente adequada para analisar caminhos mecanicistas devido ao alto nível de sintonia individual de cada sinal vinculado ao ECM. Além disso, métodos populares para micropatterning celular, incluindo impressão de microcontatos, podem ser alcançados nos substratos para permitir a adesão celular controlada para analisar a forma celular em relação a outras pistas ligadas ao ECM²⁴. Isso é fundamental porque substratos padronizados de linha, que promovem o alongamento em populações celulares, fornecem uma ferramenta para imitar e estudar SCs alongados e regenerativos dentro de bandas Büngner durante a regeneração nervosa. Além disso, a morfologia celular é um potente regulador de múltiplas funções celulares e pode potencialmente introduzir resultados experimentais confusos se não for controlada^26,27. Atenção significativa está sendo dada aos mecanismos que regem o fenótipo regenerativo de SC, conforme regulado pelas sugestões ECM^28,,29,,30. Isso é essencial para fornecer uma visão sobre o desenho de biomateriais que podem ser aplicados como conduítes de orientação nervosa para auxiliar na regeneração nervosa da PNS. Esses protocolos detalhados podem, em última análise, ser aplicados como uma ferramenta potencial para decifrar os mecanismos de SC e outros tipos de células funcionam conforme regulado por pistas vinculadas ao ECM.

Protocol

1. Preparação e caracterização da cultura celular incapaz Preparação de substrato Misture o elastômero base PDMS e os agentes de cura usando uma ponta de pipeta vigorosamente em uma relação entre 10:1 e 60:1 até que as bolhas sejam dispersas homogêneamente dentro da mistura. Remova bolhas usando a proficação do vácuo até que as bolhas sejam dissipadas.NOTA: Durante a polimerização do PDMS, o agente de cura cruza com o elastômero base para fornecer propriedades me…

Representative Results

Para analisar e quantificar a interação entre rigidez do substrato e composição proteica no fenótipo de SC, foi desenvolvido um substrato de cultura celular PDMS tunable(Figura 1A). Testes de compressão do polímero em base diferente: foram utilizadas relações de agente de cura para quantificar o módulo do Jovem (E) do substrato(Figura 1B). A faixa resultante de valores de módulo representa condições de substrato fisiologicamente relevantes. Após a …

Discussion

As SCs podem promover a regeneração nervosa devido à sua transformação fenotípica e potencial regenerativo após lesão nervosa. No entanto, a forma como as sugestões de ECM regulam essa capacidade regenerativa permanece em sua maioria incerta, potencialmente dificultando não apenas o desenvolvimento de biomateriais que visam promover a regeneração nervosa, mas também a compreensão dos mecanismos envolvidos na regeneração nervosa. Para começar a examinar essa interação, substratos de cultura celular fora…

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate	Thermo Fisher Scientific	A23017	BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076S	Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074S	Antibody used for western blot analysis
BrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	B35130	Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	Protein used to coat coverslips
Compression force test machine	TestResources		Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Cell culture medium supplemental
Fibronectin	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti2	Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78440	Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36971	Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody	Thermo Fisher Scientific	711202	Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody	Cell Signaling Technology	3700S	Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	Photoresist
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody	Cell Signaling Technology	9165S	Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody	Abcam	ab40390	Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody	Cell Signaling Technology	8238S	Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer	Abcam	ab156034	Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line	ATCC	CRL-2768	Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent	Sigma Aldrich	761036	Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	15090-046	Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner	Novascan		Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	Cell dissociation reagent