सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में कालक्रम जीवनकाल को विनियमित करने वाले आनुवंशिक लिंक के लक्षण वर्णन के लिए एक दमन स्क्रीन
Summary
यहां सैकरोमाइसेस सेरेविसियामें बढ़ी हुई कॉपी नंबर दबाने वाले स्क्रीन के माध्यम से आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल है । यह विधि शोधकर्ताओं को अल्पकालिक खमीर म्यूटेंट में दबाने वालों की पहचान करने, क्लोन करने और परीक्षण करने की अनुमति देती है। हम ऑटोफैगी नल उत्परिवर्ती में उम्र पर SIR2 की कॉपी संख्या में वृद्धि के प्रभाव का परीक्षण करते हैं।
Abstract
उम्र बढ़ने से एक जीव की सामान्य जैविक प्रक्रियाओं का समय निर्भर गिरावट है जो मृत्यु की संभावना को बढ़ाता है। कई आनुवंशिक कारक सामान्य उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में परिवर्तन में योगदान देते हैं। ये कारक जटिल तरीकों से छेड़छाड़ करते हैं, जैसा कि कई जीवों में पहचाने गए और संरक्षित दस्तावेज लिंक के धन से पता चलता है। इनमें से अधिकांश अध्ययन नुकसान-कार्य, नल म्यूटेंट पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो एक साथ कई जीनों की तेजी से जांच करने की अनुमति देते हैं। बहुत कम काम है जो इस प्रक्रिया में जीन की अधिक एक्सप्रेशन की भूमिका की विशेषता पर केंद्रित है। वर्तमान कार्य में, हम कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि में देखे गए अल्पकालिक कालक्रम जीवन कालण फेनोटाइप के दमन में अध्ययन के लिए नवोदित खमीर, सैकरोमाइसेस सेर्विसियामें जीन की पहचान और क्लोन करने के लिए एक सीधी पद्धति प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की पृष्ठभूमि और विभिन्न अकादमिक चरणों में शोधकर्ताओं के लिए सुलभ होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। SIR2 जीन, जो एक हिस्टोन deacetylase के लिए कोड, pRS315 वेक्टर में क्लोनिंग के लिए चुना गया था, के रूप में वहां कालक्रम उम्र पर इसके प्रभाव पर परस्पर विरोधी रिपोर्ट किया गया है । SIR2 भी ऑटोफैगी में एक भूमिका निभाता है, जो परिणाम जब प्रतिलेखन कारक ATG1सहित कई जीन के हटाने के माध्यम से बाधित । सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम SIR2 जीन क्लोन करने के लिए छोटा उम्र की कमी atg1 म्यूटेंट की छोटा उम्र फेनोटाइप विशेषता पर एक दमन स्क्रीन प्रदर्शन और यह एक अंयथा आइसोजेनिक, जंगली प्रकार आनुवंशिक पृष्ठभूमि से तुलना करें ।
Introduction
उम्र बढ़ने असंख्य जैविक प्रक्रियाओं में अखंडता का समय निर्भर नुकसान है जो अंततः संगठित मृत्यु की संभावना को बढ़ाता है। उम्र बढ़ने सभी प्रजातियों के लिए लगभग अपरिहार्य है। सेलुलर स्तर पर कई अच्छी तरह से विशेषता वाली पहचान हैं जो उम्र बढ़ने से जुड़ी होती हैं, जिनमें शामिल हैं: जीनोमिक अस्थिरता, एपिजेनेटिक परिवर्तन, हानि-प्रोटेओस्टेसिस, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, नियंत्रणमुक्त पोषक तत्व संवेदन, सेलुलर सेन्सेंस, और टेलोमेरे उदासीनता1,,2। खमीर जैसे एकल कोशिकीय जीवों में, इससे प्रतिकृति क्षमता और कालक्रम जीवन काल3,,4में कमी आती है। ये सेलुलर परिवर्तन मनुष्यों की तरह अधिक जटिल जीवों में प्रकट होते हैं, जैसे कि कैंसर, हृदय विफलता, न्यूरोडिजेनरेशन, मधुमेह और ऑस्टियोपोरोसिस5,,6,,7शामिल हैं। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को चित्रित करने वाली कई जटिलताओं के,बावजूद, व्यापक रूप से भिन्न जीवों8,9,10में इस प्रक्रिया को अंतर्निहित इन आणविक पहचान का संरक्षण है।, वृद्धावस्था के दौरान इन रास्तों में परिवर्तन की पहचान करने से यह अहसास हुआ कि जीवनशैली में बदलाव के माध्यम से उनमें हेरफेर किया जा सकता है – आहार प्रतिबंध कई जीवों में उम्र बढ़ाने के लिए दिखाया गया है11. ये रास्ते जटिल तरीकों से एक-दूसरे और कई अन्य रास्तों के साथ एकाग्र और एक दूसरे को एक दूसरे से छेड़छाड़ करते हैं । इन बातचीतों की स्पष्टता और लक्षण वर्णन 12 , 13,14 ,,1414उम्र और स्वास्थ्य को लम्बा करने के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेपों की क्षमता प्रदान करता है ।13
वृद्धावस्था के आणविक आधार का संरक्षण सरल मॉडल जीवों के उपयोग के माध्यम से प्रक्रिया में अंतर्निहित आनुवंशिक बातचीत के कार्यात्मक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है – जिसमें नवोदित खमीर, सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई15,16शामिल हैं । नवोदित खमीर द्वारा मॉडलिंग उम्र बढ़ने के दो स्थापित प्रकार हैं: कालक्रम उम्र बढ़ने (कालक्रम उम्र, सीएलएस) और प्रतिकृति उम्र (प्रतिकृति उम्र, आरएलएस)17। कालक्रम उम्र बढ़ने से उस समय की मात्रा मापता है जो एक कोशिका गैर-विभाजित अवस्था में जीवित रह सकती है। यह उन वृद्धावस्था के अनुरूप है जो उन कोशिकाओं में देखी जाती हैं जो अपने अधिकांश जीवन जी0में बिताती हैं , जैसे न्यूरॉन्स4. वैकल्पिक रूप से, प्रतिकृति उम्र कई बार है कि एक कोशिका थकावट से पहले विभाजित कर सकते है की संख्या है और मिटोटिक रूप से सक्रिय सेल प्रकार के लिए एक मॉडल है (जैसे, बेटी कोशिकाओं की संख्या है कि एक सेल हो सकता है)18।
इस विधि का समग्र लक्ष्य एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करना है जो एस सेरेविसियाका उपयोग करके एजिंग की आनुवंशिकी के कार्यात्मक विच्छेदन की अनुमति देता है। हालांकि कई शोधकर्ताओं द्वारा किए गए कई उत्कृष्ट अध्ययन हुए हैं जो हमारी वर्तमान समझ के कारण हुए हैं, नवोदित शोधकर्ताओं के लिए अपने अकादमिक कैरियर की शुरुआत से उम्र बढ़ने के क्षेत्र में योगदान करने के लिए कई अवसर उपलब्ध हैं। हम एक स्पष्ट कार्यप्रणाली पेश करते हैं जो शोधकर्ताओं को उम्र बढ़ने के क्षेत्र को आगे बढ़ाने की अनुमति देगा। यह प्रोटोकॉल अपने स्वयं के उपन्यास परिकल्पनाओं को तैयार करने और परीक्षण करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करके अपने अकादमिक कैरियर में मंच की परवाह किए बिना सभी शोधकर्ताओं के लिए सुलभ होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हमारे दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह एक लागत प्रभावी तरीका है जो संस्था की परवाह किए बिना सभी शोधकर्ताओं के लिए आसानी से सुलभ है – और कुछ प्रोटोकॉल19के लिए आवश्यक महंगे, विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार की स्क्रीन को डिजाइन करने के कई अलग-अलग तरीके हैं, इस काम में उल्लिखित दृष्टिकोण विशेष रूप से गैर-आवश्यक जीन के शून्य म्यूटेंट को स्क्रीन करने के लिए उत्तरदायी है जो खमीर के आइसोजेनिक जंगली-प्रकार के तनाव की तुलना में कालक्रमीय जीवन काल में गंभीर कमी प्रदर्शित करते हैं।
सिद्धांत के हमारे सबूत के रूप में, हम SIR2क्लोन करते हैं, एक lysine deacetylase दोनों एक विस्तारित और एक छोटा सील्स प्रदर्शन के रूप में रिपोर्ट जब overexpressed । SIR2 अतिउपप्रयोग हाल ही में वाइनमेकिंग यीस्ट में सीएसएस बढ़ाने के लिए पाया गया था; हालांकि, कई समूहों SIR2 और CLS विस्तार के बीच कोई संबंध की सूचना दी है,विशेषता 20, 21, 22,21,के तहत अपनी भूमिका छोड़। साहित्य में इन परस्पर विरोधी रिपोर्टों के कारण, हमने इस जीन का चयन स्वतंत्र अनुसंधान जोड़ने के लिए किया ताकि कालक्रम की उम्र में SIR2 की भूमिका को स्पष्ट करने में मदद मिल सके, यदि कोई हो । इसके अतिरिक्त, एक SIR2 समरूप की प्रतिलिपि संख्या में वृद्धि एक सूत्रकृमि कृमि मॉडल प्रणाली23में उम्र का विस्तार करती है ।
ऑटोफैगी एक इंट्रासेलुलर रक्षित प्रणाली है जो प्रोटीन और ऑर्गेनेल्स जैसे साइटोसोलिक उत्पादों को लाइसोसोम24तक पहुंचाने के लिए है। ऑटोफैगी को सेलुलर होमोस्टेसिस25को बनाए रखने के लिए क्षतिग्रस्त प्रोटीन और ऑर्गेनेल्स को अपमानजनक बनाने में अपनी भूमिका के माध्यम से दीर्घायु से परिचित रूप से जोड़ा जाता है। ऑटोफैगी का प्रेरण कई जीनों की अभिव्यक्ति को आर्केस्ट्रा करने पर निर्भर करता है, और एटीजी 1 जीन को हटाने के परिणामस्वरूप नवोदित खमीर26में असामान्य रूप से कम सील्स होता है। एक प्रोटीन सेरीन/थ्रेनिन किनेज़ के लिए ATG1 कोड जो ऑटोफैगी और साइटोप्लाज्म-टू-वैक्यूल (फंगल lysosomal समकक्ष) मार्ग27,,28में वेसिकल गठन के लिए आवश्यक है। यहां, हम एक बढ़ी हुई कॉपी संख्या स्क्रीन के लिए अपनी विधि प्रस्तुत करते हैं, जो सील्स पर एक जंगली प्रकार और एक atg1-शून्य पृष्ठभूमि में बढ़ी हुई SIR2 कॉपी के प्रभाव का परीक्षण करते हैं। यह विधि मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में कनिष्ठ शोधकर्ताओं और अनुसंधान समूहों के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है, जिनमें से कई विज्ञान में कम प्रतिनिधित्व समुदायों की सेवा करते हैं और सीमित संसाधन हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
उम्र बढ़ने की आनुवंशिकी को खोलना एक कठिन चुनौती है, आगे के अध्ययन के लिए कई अवसरों के साथ जो संभावित रूप से मौजूद जटिल बातचीत में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं। ऐसे कई तरीके हैं जो खमीर<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेम्स टी। अर्नोन विलियम पैटरसन विश्वविद्यालय में २०१७ और २०१८ में Recombinant डीएनए टेक्नोलॉजीज कोर्स में छात्रों के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं, जो अपनी स्थापना से इस परियोजना में शामिल थे, लेकिन जिनके प्रयासों ने लेखक के लिए दहलीज पार नहीं की: क्रिस्टोफर एंडिनो, जुआन बोटेरो, जोसेफिन बोजान, ब्रेंडा कैलाल्पा, ब्रेंडा क्यूबास, हेडटलव एस्सेल डैडी, इरविन गैमर, Preciousgi , वेन को, नेल्सन मेजिया, हेक्टर मोटोला, राब्या नाज, अब्दुल्ला ओदेह, पर्ल पगंटलन, डेनियल रजाई, गैब्रिएला रेक्टर, ऐदा शोनो और मैथ्यू सो । तुम महान वैज्ञानिक हो और मैं तुम सब याद आती है!
लेखक विलियम पैटरसन विश्वविद्यालय में उनकी मदद के लिए अनुदेश और अनुसंधान प्रौद्योगिकी के अमूल्य समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: ग्रेग मैटिसन, पीटर कैनरोज़ी, रोब मेयेर, डांटे पोर्टेला और हेनरी हेनिश। लेखकों को भी कला समर्थन के लिए प्रोवोस्ट के कार्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं, डीन के कार्यालय और विज्ञान और स्वास्थ्य के कॉलेज में अनुसंधान के लिए केंद्र इस काम के अपने समर्थन, और इस परियोजना का समर्थन करने के लिए जीव विज्ञान विभाग ।
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
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